显微镜的发展

2. 近场光学显微镜

近场光学显微镜是对远场光学显锻镜的革命性发展。它的结构示意如图2



图2近场光学显微镜

由图2可看出它由局域光源，激光器、光纤探针样品台，光学放大系统组成。

传统的远场光学显微镜的分辨能力一直局限于它的波长λ或孔径nsinθ参数的大小，而近场光学显微镜的工作方式是将小于波长的超分辨极限的精细结构和起伏的信息从近场区的电磁场（隐失场）获取，然后再将含该信息的隐失场变换为可进行能量输送的传播场，使放在远处的探测场和成像器件可以接受到隐含在隐失场中的超分信息，从而进行测量。

它的工作原理是，当发生光衍射现象时，利用光的可逆性，即光的传播方向反转时，光将沿入射的途径逆向传播，故用含有超分辨信息的隐失波照射具有小于波长的精细结构或空间起伏的物体，如光栅，小孔，则这些光栅或小孔可把隐失波转换成含有超分辨信息的传导播，为远处探测器所接受。故它的核心部件是近场探测的小孔装置，常用的探针有小孔探针、无空探针，等离子激元探针。

近场显微镜的特点是样品照明和样品收集这两者必须至少有一个是工作在近场，而传统光学显微镜两者都工作在远场；近场显微镜采取的是网络状扫描成像的方法。常用的近场显微镜有扫描隧道显维镜和原子力显微镜。

3. 电子显微镜

电子显微镜的成像原理是根据电子光学原理，以电子束为介质，用电子束和电子透镜代替传统的光束和光学透镜。电子显微镜利用电磁场偏折、聚焦电子及电子与物质作用所产生散射之原理来研究物质构造及细微结构的精密仪器。

由DeBroglie的波动理论：λ=h/mv=h/(2qmv)^1/2可以看出电子束的波长仅与加速的电压有关（电子束的电量及质量为固定）。根据瑞莱准则：当不相干照明时；s=0.61λ/(nxsinθ）=0.61λ/NA；当相干光照明时，s=0.7λ/(nxsinθ)-0.77λ/NA：由此可以得出电子束的波长变化直接影响显微镜的分辨能力。由于DeBroglie的波动理论的发现使人们改变了传统观念光的波长不可变，从而产生了电子显微镜，使得显微镜的解析度和放大倍数得到了数量级的飞跃。电子显微镜的构造与光学显微镜的原理相似，由三部分组成：即聚光镜、物镜和投影镜（目镜）。它的光路原理如图3




图3 电子显微镜成像光路

电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜（反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等）和（扫描透式）显微镜。

4. 穿透式电子显微镜(TEM)

穿透式电子显微镜主要由照明系统、成像系统、影像转换系统和真空系统组成。TEM的成像原理：电子束透过样品后经过电磁透镜的聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察，从而得到高倍率的放大图像。它的电子枪在镜筒的顶部，电子由钨丝热阴极发射出，通过第一、第二两个聚光镜使电子束聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜上，再通过中间镜和投影镜逐级放大，成像于荧光屏或照相干版上。中间镜主要通过对砺磁电流的调节，放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍：改变中间镜的焦距，即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。

透射式电子显微镜的解像能力及仪器的整体性能主要由电子枪决定。电子枪主要由阴极和阳极组成，阴极（灯丝）作为电子源，阳极是用来作为电子束的加速用的。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50-100nm）。其制备过程与石蜡片片相似，但要求极严格。

透射式电子显微镜主要特点为热场发射电子枪、分析型高分辨极靴．高分辨分析型电镜等。主要用于显微结构分析、晶粒形貌、晶体缺陷、纳米颗粒大小，界面结构、高分辨晶格像、微区成分分析等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构。

5. 扫描式电子显微镜(SEM)

扫描式电子显微镜(SEM)主要由提供并聚集电子于标本上产生讯息的主体和显示影像的显像系统两部分组成。SEM的成像原理：从电子枪发出的电子束经过聚束镜、偏转线圈和物镜后，照射到样品上，将表面产生的讯号（二次电子，背向反射电子，吸收电子，X射线等）收集并放大处理后，输入到同步扫描的阴极射线管，从而显示出试片的图形。由于扫描式电子显微镜是采用电子束在样品上扫描，所以必须先将样品作固定处理。为了避免电子束在照射到标本表面之前与残留的气体分子相撞，所以扫描式电子显微镜必须保持在一定的高真空环境下工作，因此样品需作脱水和临界点干燥法等前处理。因为有些标本属于非导电性，电荷累积在试片的表面就要产生排斥力，使电子束受到干扰，扫描结果不准确，甚至无法进行扫描观察，同时，由于电子束对样品进行扫描时，入射的电子会把入射的部分能量转化为热能，使样品表面及亚表面层的温度升高。最后为了避免标本在电子束扫描是因高温而遭破坏及增加二次电子的产生来得到更加清晰的影像，必须在标本的表面上覆盖一层金属或碳的薄膜。

扫描式电子显微镜主要特点为冷场发射电子枪，强力磁圆锥透镜，高度集成化和自动化。主要用于纳米材料显微结构、尺寸分析，材料微结构、相组成及相分布分析，材料中元索定性分析，定量分析、线分析、面分析、材料失效分析等，它的应用非常广泛，导电、非导电性样品均可以观察。扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌，其成像分辨宰高于光学显微镜。

6. 扫描穿透式电子显微镜(STEM)

扫描穿透式电子显礅镜由电磁透镜系统，高电压系统和真空系统组成。STEM的成像原理是高电压系统产生加速电压，送入镜筒上端的电子枪，使其发射出电子束，发出的电子束经过聚光镜后透射过样品，再经过物镜、中间镜、投影镜（二级放大）将其影像放大。

扫描穿透式电子显微镜的解析度主要取决于两个因素，即电子的波长和透镜的缺陷。由德布罗意的波长理论可知，加速电压越高，波长越短，解析度也越好，同时电子的动能加大，电子对试片的穿透力也加大，所以试片可观察厚度也可相对增加。另外一个影响因素是像差（绕射像差，球面像差，散光像差，波长散步像 差）。由于STEM兼具有SEM的功能，故STEM也能用来检测样品的表面结构，井可作微区线扫描。此外，STEM电子显微镜中不仅能看到原子，提供影像，还可以通过对电子显微镜和电子绕射圆形的计算分析，得到理论上的结论。

7. 激光共焦显微镜

随着现代激光技术的发展，除了前面提到的光学和电子显微镜外，现如今推出几种新型显微系统，叫共焦激光显微镜。它是建立在光学显微镜及各种扫描显微镜基础上的一种新型的扫描成像系统。

激光扫描显微镜的成像原理：利用聚焦的激光束在样品表面扫描，同时利用光电检测器件接收样品反射光（或透射光），样品结构的变化使反射光（或透射光）强度改变，因而使光电检测器的输出电流改变，经信号处理，同步显示在计算机屏幕上。

激光共焦显微镜的优点是：清晰度大为提高，用于生物医学研究时，可以清楚地看到细胞内部某一个层面，细胞水平的CT，其分辨率比普通光学显微镜高约1.5倍。激光共焦显微镜采用了共焦方法，可以在光束能透人的范围内实现深度剖面的分层成像，因此成为研究薄膜材料、集成电路及生物组织乃至细胞等的微细结构及其深度剖面的非常有效的工具。由于照射在样品的是聚焦的激光束，具有很小的直径，因此没有来自邻近区域的散射光的影响，从而可以提高信噪比，即增强了对比度。同时由于激光扫描最微镜是直接接收反射光（或透射光），因此检测灵敏度高，且检测系统比较简单。

三、展望

许多年来，人们一直致力于提高显微镜的分辨能力和成像衬度。随着计算机技术和工具的不断进步，光学设计的理论和方法也在不断改进，学科的交叉和联系越来越紧密，使得显微镜与激光、计算机、新材料技术、信息技术相结台，显微成像技术大大提高。近年来随着近场穿透式电子显微镜、扫描式电子显微镜以及激光共焦显微镜的发展和广泛应用，为人类获得新型材料以及促进现代医学的发展创造了条件，应用广泛的纳米材料就是在电子显微镜的基础上发展起来的，它为21世纪科学技术的发展奠定了基础，在材料，生物、医学等领域得到广泛的应用。因此显微镜的研究具有重要意义。

显微镜的发展：人类很早以前就有探索微观世界奥秘的要求，但是苦于没有理想的工具和手段。1675年荷兰生物学家列文虎克用显微镜发现了十分微小的原生动物和红血球，甚至用显微镜研究动物的受精作用。列文虎克掌握了很高的磨制镜片的技艺，制成了当时世界上最精致的可以放大270倍的显微镜。以后几百年来，人们一直用光学显微镜观察微观和探索眼睛看不到的世界，但是由于光学显微镜的分辨率只能达到光波的半波长左右，这样人类的探索受到了限制。进人20世纪，光电子技术得到了长足的发展，1933年德国人制成了第一台电子显微镜后，几十年来，又有许多新型的显微镜问世，比如，扫描隧道显微镜（STM）就是一种比较先进的现代仪器。））

很早以前，人们就知道某些光学装置能够“放大”物体。比如在《墨经》里面就记载了能放大物体的凹面镜。至于凸透镜是什么时候发明的，可能已经无法考证。凸透镜——有的时候人们把它称为“放大镜”——能够聚焦太阳光，也能让你看到放大后的物体，这是因为凸透镜能够把光线偏折。你通过凸透镜看到的其实是一种幻觉，严格的说，叫做虚像。当物体发出的光通过凸透镜的时候，光线会以特定的方式偏折。当我们看到那些光线的时候，或不自觉地认为它们仍然是沿笔直的路线传播。结果，物体就会看上去比原来大。



单个凸透镜能够把物体放大几十倍，这远远不足以让我们看清某些物体的细节。公元13世纪，出现了为视力不济的人准备的眼镜——一种玻璃制造的透镜片。随着笼罩欧洲一千年的黑暗消失，各种新的发明纷纷涌现出来，显微镜（microscope）就是其中的一个。大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹森 （Zaccharias Janssen）和他的儿子把几块镜片放进了一个圆筒中，结果发现通过圆筒看到附近的物体出奇的大，这就是现在的显微镜和望远镜的前身。

詹森制造的是第一台复合式显微镜。使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的的放大倍数就是10*20=200倍。



1665年，英国科学家罗伯特·胡克（人们可能更熟悉他的另一个发现：胡克定律）用他的显微镜观察软木切片的时候，惊奇的发现其中存在着一个一个“单元”结构。胡克把它们称作“细胞”。不过，詹森时代的复合式显微镜并没有真正显示出它的威力，它们的放大倍数低得可怜。荷兰人安东尼·冯·列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek ，1632-1723)制造的显微镜让人们大开眼界。列文虎克自幼学习磨制眼镜片的技术，热衷于制造显微镜。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的单片显微镜的放大倍数将近300倍，超过了以往任何一种显微镜。



当列文虎克把他的显微镜对准一滴雨水的时候，他惊奇的发现了其中令人惊叹的小小世界：无数的微生物游曳于其中。他把这个发现报告给了英国皇家学会，引起了一阵轰动。人们有时候把列文虎克称为“显微镜之父”，严格的说，这不太正确。列文虎克没有发明第一个复合式显微镜，他的成就是制造出了高质量的凸透镜镜头。



在接下来的两个世纪中，复合式显微镜得到了充分的完善，例如人们发明了能够消除色差（当不同波长的光线通过透镜的时候，它们折射的方向略有不同，这导致了成像质量的下降）和其他光学误差的透镜组。与19世纪的显微镜相比，现在我们使用的普通光学显微镜基本上没有什么改进。原因很简单：光学显微镜已经达到了分辨率的极限。



如果仅仅在纸上画图，你自然能够“制造”出任意放大倍数的显微镜。但是光的波动性将毁掉你完美的发明。即使消除掉透镜形状的缺陷，任何光学仪器仍然无法完美的成像。人们花了很长时间才发现，光在通过显微镜的时候要发生衍射——简单的说，物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑*得太近，你就没法把它们分辨开来。显微镜的放大倍数再高也无济于事了。对于使用可见光作为光源的显微镜，它的分辨率极限是0.2微米。任何小于0.2微米的结构都没法识别出来。



提高显微镜分辨率的途径之一就是设法减小光的波长，或者，用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，它的“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，并且汇聚它，就有可能用来放大物体。

1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜（TEM）。1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。电子显微镜是20世纪最重要的发明之一。由于电子的速度可以加到很高，电子显微镜的分辨率可以达到纳米级（10-9m）。很多在可见光下看不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下现出了原形。



用电子代替光，这或许是一个反常规的主意。但是还有更令人吃惊的。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了所谓的扫描隧道显微镜（STM）。这种显微镜比电子显微镜更激进，它完全失去了传统显微镜的概念。



很显然，你不能直接“看到”原子。因为原子与宏观物质不同，它不是光滑的、滴溜乱转的削球，更不是达·芬奇绘画时候所用的模型。扫描隧道显微镜依*所谓的“隧道效应”工作。如果舍弃复杂的公式和术语，这个工作原理其实很容易理解。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压。如果探针距离物体表面很近——大约在纳米级的距离上——隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。

因为这项奇妙的发明，Binnig和Rohrer获得了1986年的诺贝尔物理学奖。这一年还有一个人分享了诺贝尔物理学奖，那就是电子显微镜的发明者Ruska。

据说，几百年前列文虎克把他制作显微镜的技术视为秘密。今天，显微镜——至少是光学显微镜——已经成了一种非常普通的工具，让我们了解这个小小的大千世界。