省部重点实验室
第1楼2012/03/09
三、色谱条件的选择
前面讨论用峰高还是用峰面积作定量计算时,曾经讨论过色谱条件对峰高和峰面积的影响,这些影响将直接影响到色谱定量分析的准确性和重复性。在保证分离度>1. 5的条件下,柱效的变化对采用峰面积定量的定量分析结果没有影响,而对使用峰高定量的定量分析结果会产生影响。流动相流速的变化对以相对法定量的归一化法,内标法和标准加入法的定量分析结果没有影响,而对标准曲线法的定量分析结果会产生影响。流动相流速的变化对标准曲线法中峰面积定量的定量分析结果的影响比峰高定量的定量分析结果的影响要大,故在流动相流速不易控制时,若应用标准曲线法定量,应采用峰高定量。
在气相色谱中,柱温的变化会影响保留时间和峰高,柱温的升高将使保留值缩短、峰高增大。柱温变化对峰高的影响随分子量增加面增大,这说明柱温的变化对各组分的峰高的影响是不等效的,即使是以相对法定量的归一化法、内标法和标准加入法也无法消除柱温的变化对峰高大小的影响。在特定条件下得到的数据表明,如要求柱温的变化引起的定量分析误差小于0.5%,则柱温的变化不应超过±0.5℃。柱温的变化对峰面积大小的影响较小,故在气相色谱中多采用峰面积定量。
在液相色谱中,流动相的组成变化,如采用梯度洗脱时,固定相、洗脱液和欲测组分之间的平衡很难保持严格一致,加之梯度洗脱时基线经常出现漂移,使峰面积和峰高的侧量容易产生较大的误差、故在液相色谱定量分析中不采用梯度洗脱,而且要尽量保待洗脱液组成的稳定。
总之在色谱定量分析中,一要尽可能保持色谱条件的稳定,保证每次进样时色谱条件尽可能保待一致。
四、检测器特性
检测器工作的稳定性和线性范围将直接影响色谱定量分析结果的准确性和重复性。
色谱定量分析的基础是:
ω=ƒiAi(hi)
这就要求检测器对所测组分的响应值与所测组分的含量呈线性关系。实际上任何检测器的响应都有一定的线性范围(参见本丛书《气相色谱检测方法》和《液相色谱检侧方法》两书),超出这一范围,检测器的响应值与含量之间的关系将偏离线性范围,这时再用上述公式计算,必将会产生较大的误差。所以。要想获得准确的定量分析结果,进样量绝不能使进入检测器的被测组分含量超出检测器的线性范围。选用的进样量最好能使检测器的响应值落在其线性范围的中间部分,此时的误差最小。
不同类型的色谱检测器影响其工作稳定性的因素是不同的,如气相色谱中的氢火焰离子化检测器工作的稳定性主要受燃气—氢气和空气的比例和流速以及载气的流速影响很大。要保持氢火焰离子化检测器定量分析结果的重现性在1%之内,就要求空气和氢气的流速应控制在1.5%的精度,载气流速应控制在2%的精度。又如,气相色谱中的热导检测器,要求池体的温度控制精度为±0.05℃时才能得到稳定的定量分析结果。有关影响各种类型检测器工作稳定性的因素可以参见本丛书的《气相色谱检测方法》和公液相色谱检测方法》两本专著。
对于某些特殊组分可使用选择性检测器,使某些干扰物在选择性检测器上不被检出,从而可以消除干扰,得到较好的定量分析结果。
总之,可以通过选择合适的检测器和检测器的工作参数,使色谱定量分析中由检测器引起的误差降到最低。
五、分离度
分离度大小将影响峰高和峰面积测量的准确度,而峰高和峰面积测量的准确度将直接影响色谱定量分析的准确度。分离度对峰高和峰面积测量准确度的影响在前面“峰高和峰而积的准确测定”和“峰高和峰而积法选择”两小节中作了详细的讨论,在此就不多述了。
以下讨论峰高法和峰面积法的选择
峰高法和峰面积法的选择
在色谱定量分析中,选用峰高法还是选用峰面积法,主要决定在检测器的线性范围内,峰高和峰面积侧量的准确性和重复性。除了归一化法最好用峰面积法外。其他三种定量方法中峰高和峰面积都可用作精确的定量方法。
在检侧器的线性范围内,峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度的影响,要准确地侧量峰高和峰面积,色潜分高应达到一定的分离度才行。图3-18至图3-22给出了峰高比1/1至16/1时的标准分离度曲线,每张图上的黑点表示了每个蜂峰尖的真实位置,此黑点与图中所示的峰尖的垂直位移就是测量误差。峰高比越大,要求能准确测童峰高的分离度也越大。峰高比为1/1和l/2时,峰高能得到准确测量的最低分离度为0.8,峰高比为4/1时,峰高能得到准确测量的最低分离度为1.0;峰高比16 /1时,峰高能得到准确测量的最低分离度为1.25。关于分离度对峰高测定准确度的影响大致可认为:当分离度Rs=1.0时,相对峰高从128:1变化到 1:128时,峰高的测量误差小于士3%。
分离度对峰面积测量的影响较峰高要大,图3-23给出了分离度Rs= 1.0和不同峰高比时,面积较小峰的峰面积测量值为其真实面积的百分数。由图可见,当峰高比大时,面积较小峰的峰面积测量准确度降低,此时测量较大峰的峰面积较准确,误差不超过1%。小峰峰面积测量误差都是负值,而大峰峰面积测量误差都是正值。'
如果两个重叠峰峰高比为χ , χ>l),则两个峰峰面积侧量误差关系为:
较大峰峰面积测量误差=(-1/χ)×较/卜峰峰面积测量误差
在图3-22中.当峰高比为4/1时,按小峰的峰面积测量误差为-4%,此时较大峰的峰面积测量误差则为(-1 /4)×(-4%)=1%;而当峰高比为16/1时,较小峰的峰面积测量误差为-12%,此时较大峰的峰面积测量误差则为(-1 /16)×(-12%)=0.8%。由此可见,当分离度不好时,侧量小峰的峰面积的误差比测量小峰的峰高的误差要大。此时测量大峰的峰面积误差稍小些,但仍比测垫大峰的峰高的误差要大些。前面已指出当分离度Rs=1.0,当峰高比从l28/1至1 /128时,峰高的测量误差最大为士3%;而当分离度Rs=1.0,若要求峰面积的测量误差在士3%之内时,估计峰高比只能从3 / 1至1/3。所以,峰面积定量方法比峰高定量方法要求有更好的分离度。在分离度不好的情况下,用峰面积定量时,可以从峰谷高(h1)与小峰峰高(h2)之比来估算测量小峰峰而积的相对误差(图3-24)。
表3-12列出了不同h1/h2时,测量小峰峰面积的相对误差。
峰高和峰面积的准确侧量还受到色谱分离参数——容量因子(k’),柱理论塔板数(n)和流动相流速(u)的影响。L.R.Synder等人根据浓度型检测器(如GC的TCD、ECD;HPLC的UV、 RI、荧光检测器等)的特点,建立了一些规则来予测各种色谱分离参数改变时,对检测器的响应值,继而对定量分析时测量峰高和峰面积的准确度的影响(见表 3-13)。
由表3-13数据可看出:当流动相(GC的载气,HPLC的洗脱流)流速可以准确控制,而影响容量因子(k’)的一些因素(如GC的柱温、HPLC的流动相的组成)不能保持恒定(如使用GC的程序升温,HPLC的梯度洗脱)时,用峰面积定量较好;而当容量因子(k’)和柱效(n)保持不变,流动相流速不稳定。有微小变化时,峰高受到的影响要小于峰面积,此时用峰高定量能得到较为精确的定量结果。当柱效(n)有所变化时,使用峰面积定量可得到较精确的结果。
总之,在分离度较好,色谱峰形较好,峰面积可以准确测量时,以用峰面积法定鸳为好。特别是在气相色谱使用程序升温和液相色谱使用多元梯度洗脱时,最好使用峰面积法定量。但当分离度不好,色谱峰形不好(如严重拖尾)时,峰面积测量引起的误差较大,此时使用峰高法定量较好。保留时间短的色谱峰峰形较尖(峰尾宽较小),此时峰高测定较峰面积测定准确,宜用峰高法定量;面保留时间长的色谱峰峰形较宽(峰尾宽较大〕,此时峰面积测定较峰高测定准确,宜用峰面积法定量。