省部重点实验室
第1楼2012/04/29
来自军事医学科学院的谢剑炜研究员做了题为《芥子气暴露的确证》的报告。首先谢研究员介绍了芥子气暴露的确证研究的背景。
芥子气(HD)是一种糜烂性化学毒剂,曾多次应用于战争中,造成大量人员伤亡,二战期间侵华日军就曾经在中国各地遗弃可大量化学武器,对周边地区人民构成了巨大威胁。芥子气具有复杂的生物学作用机制,可与人体内的核酸、蛋白质、酶作用,使得细胞的代谢和功能发生障碍,导致变性、炎症和坏死。因此芥子气暴露确证技术的研究非常重要。
芥子气是一种双功能烃化剂,在生理条件下极容易发生亲电反应。目前,对于芥子气暴露确证技术的研究的难点主要集中在以下几点:
(1)毒理机制尚不十分明确;(2)暴露后有潜伏期,不能及时诊断;(3)症状与烧伤、化学伤类似;(4)靶器官广泛,无特效解毒药。
生物标志物是生物体内污染物暴露剂量和生物效应的指示剂。在毒物风险评估、暴露确证、疾病预警、防治效果评价等方面起着重要作用。生物标志物检测方法的研究是芥子气中毒或暴露确证的基础,对芥子气中毒的临床快速诊断,中毒程度的评估以及针对性的医疗救治具有重要意义。
芥子气在生物体内的主要代谢途径包括水解氧化、与蛋白质加合、与DNA加合、以及与谷胱甘肽加合后经β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。芥子气的生物标志物类型包括:原型、代谢物、DNA/蛋白加合物。生物标志物如果是原型,则迅速反应;如果是代谢物,存在时间也较短(数日);如果是DNA/蛋白质加合物,可以存在几周到几个月的时间,这就更有利于核查员到当地的检测(比如如何指正几个月前曾制造过芥子气的地点)。
接下来,谢研究员详细介绍了他们实验室在这方面所做的研究。研究思路为:合成纯化相关生物标志物参考品(含同位素标记参考品),然后建立溯源性技术方法(色谱-质谱联用技术,方法遵循FDA生物分析方法认证的要求),再研究染毒动物模型的时量效关系,并从体外实验,到体内,再到诊断治疗。目前,其课题组已经分别建立了芥子气暴露后的DNA-加合物、蛋白质加合物、水解和代谢产物的高灵敏度、高选择性质谱分析技术方法:
(1)DNA加合物是由具有亲电集团的化合物或其体内代谢产物与DNA共价键合所形成的化合物,是DNA化学损伤最重要和最普遍的形式。谢研究员课题组通过大鼠的体内外染毒实验-提取DNA-水解DNA-超高压[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱[/url]-三重四极杆离子阱串联质谱技术,揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四种DNA加合物在生物体内的分布及代谢过程,从分子水平研究HD-DNA加合物与暴露剂量、损伤效应之间的联系,为HD毒理机制的深入研究提供了技术基础;其中1-21天取血样和组织样可检测DNA加合物N7-HETEG,并可作为生物标志物。
(2)采用LC-MS/MS方法,进行HD-蛋白质加合物位点的筛选与评价。芥子气与血液中丰度较高的蛋白(珠蛋白和HSA)均可发生多位点共价反应。包括球蛋白的17条肽段,HSA的24条肽段以及球蛋白的N-端V残基、HSA的Q残基,另外还有16中氨基酸残基。谢研究员分别介绍了芥子气与Glu残基、 Cys残基、HSA肽段、珠蛋白间的加合反应及其加合位点。然后设计了技术路线:HD和/或HD-d4染毒全血-取红细胞后提取蛋白-加入珠蛋白后进行Edman降解-SPE萃取后衍生化-通过同位素稀释-GC-MS(NCI)方法检测体外染毒(芥子气暴露)人全血样中的HETE-Val状况,并与家兔体外染毒情况进行了比对。结果表明N-HETE-Val可作为芥子气中毒潜伏期(染毒后15分钟)以及中毒症状消失后(103天)的诊断生物标志物和溯源性检测生物标志物。
(3)用同位素稀释-GC-MS检测尿样中的TDG和TDGO,并与家兔染毒情况进行了比对。
(4)通过家兔皮肤染毒实验,发现芥子气中毒体内谷胱甘肽加合物β-裂解产物的溯源性核查时间长达28天。对于各染毒剂量组,β-裂解产物的排出量均在前 2天的尿样中较高,3天后排出量就比较少。一周内排出总量的99%以上。结果表明β-裂解产物还原产物SBMTE因其在染毒后一段时间内存在高浓度水平,且体内无内源性物质存在,是确证芥子气暴露生物标志物之一;1-4天取血浆样,1-28天取尿样。