显微镜基本技术--切片的制作

三、取材，固定
（一） 实验动物的抓取及固定
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。
2．实验家兔的抓取及固定方法
要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。
3．豚鼠的抓取及固定方法
要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。
（二） 实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法
1．编号和标记方法
（1）染色法
标记溶液：3%~5%苦味酸 黄色
2%硝酸银 咖啡色（涂后光照10分钟）
0.5%中性红或品红 红色
龙胆紫 紫色
编号原则：先左后右，从前到后
左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。
（2）挂牌法
（3）耳孔法
一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。
2．实验动物的随机分组方法
动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。
3．实验动物被毛去除方法
剪毛法
拔毛法
剃毛法
脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。
脱毛剂配方：
（1）硫化钠3g
肥皂粉1g
淀粉7 g
加水适量调成糊状
（2）硫化钠8g
溶于100ml水中
（3）硫化钠8g
淀粉7 g
糖4 g
甘油5 g
硼砂1 g
加水75ml
（三） 实验动物处死
处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。
1．空气栓塞致死法
要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。
2．麻醉后处死法
注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。
（1）吸入麻醉法
要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火
（2）注射麻醉法
要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。
3．脑、脊破坏法
要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。
4．断头处死法
要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。
5．断椎法
要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。
（四） 实验动物解剖
解剖步骤
1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；
2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；
3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；
4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。
（五） 取材
取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。
取材方法和注意事项
（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。
（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）
（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。
（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。
（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。
（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。
（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。
（8）取材要尽量注意脏器的完整性。
（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。
（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。
（六） 固定
1．固定的目的
（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；
（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；
（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。
（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。
2．固定的对象和方法
（1）固定的主要对象是蛋白质；
（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。
（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。
①局部灌注固定：
肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。
肝、肾：经肝动脉或肾动脉注入固定液。
脑：动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。
②全身灌注固定：
步骤：取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）
3．固定液的性质和条件
（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。
（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。
（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。
（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。
（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。
4．固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；
（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；
（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；
（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；
（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；
（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液
（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。
5．固定剂
单纯固定剂
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
（3）饱和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。
（4）冰醋酸：渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。
（5）锇酸：价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。
混合固定剂
（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。
（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要12~36小时，加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。
（3）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。
（4）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。
（七） 组织块修整
固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。修整组织块时，手术切片一定要锋利。

石蜡切片基本步骤之三 水洗，脱水，透明，浸蜡包埋