液相色谱串联质谱法测定动物组织中卡巴氧和喹乙醇代谢物残留量
摘要：采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS），建立了猪肉中卡巴氧代谢物脱氧卡巴氧、喹恶啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留量的药物残留的检测方法，样品用甲酸溶液消化，蛋白酶水解，盐酸酸化，离心过滤后，过Oasis MAX固相萃取住或相当者净化。先用二氯甲烷洗脱脱氧卡巴氧，再用%甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹恶啉-2-羧酸和3-甲基喹恶啉-2-羧酸，氮气吹干洗脱液，残渣用甲酸+甲醇（19+1）溶液溶解，样液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。本方法采用了2ug/kg,5ug/kg,10ug/kg，3个添加浓度，每个浓度6个平行样品，上述3种药物残留的回收率在80%~110%，相对偏差在2.03%~4.94%。
关键词：液相色谱串联质谱法；脱氧卡巴氧；喹恶啉-2-羧酸；3-甲基喹恶啉-2-羧酸。
1 引言
卡巴氧(Carbadox) 和喹乙醇(Olaquindox) 同属喹喔啉类化合物 , 该类药物具有显著的促进动物生长的作用 , 用作猪等养殖动物的饲料添加剂。二者本身具有潜在的致畸变、致癌作用 , 其代谢物也可能带来健康风险。因此许多国家将以卡巴氧和喹乙醇列为对食用动物禁用或限用的药物 , 欧盟、中国、日本、美国、澳大利亚等对二者在动物组织内迅速代谢而产生的相应的代谢产物喹喔啉-2-羧酸(QCA)和 3-甲基喹喔啉-2-羧酸(MQ-CA)制定了残留监控的限量标准。
在动物体内，喹乙醇和卡巴氧、经脱单氧、脱双氧后主要生成脱氧卡巴氧、喹恶啉-2-羧酸、3-甲基喹恶啉-2-羧酸，相对应的代谢物比较稳定，通常作为残留分析和监控的目标物质，代谢途径见图1。鉴于喹乙醇和卡巴氧的毒性和潜在的危害，为了更好的对动物食品进行监控，本文旨在建立喹乙醇、卡巴氧代谢物的残留液质联用仪检测方法。
2 实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1试剂和材料
甲醇：德国默克，色谱纯。
乙腈：德国默克，色谱纯；
乙酸乙酯：德国默克，色谱纯；
水：1.25L哇哈哈纯净水（杭州产）；
正己烷：Honeywell，色谱纯。
甲酸：色谱纯
乙酸：色谱纯
浓盐酸：分析纯
乙酸钠：分析纯
甲酸乙酸乙酯溶液：2% 向400mL乙酸乙酯中加入10mL甲酸，用乙酸乙酯定容至500mL。
甲酸溶液0.6%：量取6.0mL，用水溶解，定容至1L
甲酸溶液0.1%：量取1.0mL，用水溶解，定容至1L
甲酸+甲醇（19+1）
盐酸溶液：0.1mol/L。 量取8.3 mL浓盐酸，用水溶解、定容至1 L
盐酸溶液：0.3mol/L。 量取25 mL浓盐酸，用水溶解、定容至1 L
Protease蛋白酶:Sigma P5147或相当者，-18℃以下保存
蛋白酶水溶液:0. 01 g/ml。称取1.00 g Protease蛋白酶(3.15)，用水溶解、定容至100 mL,4℃保存
乙酸溶液:10%。量取100 ml乙酸，用水溶解、定容至1L
乙酸钠溶液:0. 05 mol/L, pH =7。称取6. 8 g乙酸钠用800 mL水溶解，再滴加10%乙酸溶液以调节溶液pH=7，用水定容至1L。
乙酸钠+甲醇溶液(19+1)
Tris碱:Sigma T1503或相当者
Tris溶液:1.0mol/L。称取121 g Tris碱，用水溶解定容至1 L，4℃保存
阴离子交换柱:Oasis MAX 60 mg,3 ml，或相当者口用前分别用3 ml甲醇和3mL水活化，保持柱体湿润。
0.22um 滤膜。
猪肉：取自养殖基地。
标准品：购置于DR公司,纯度>90%。
标准贮备液：称取各标准品10.0mg，分别放于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，4℃保存。
1.1.2仪器
液相色谱—质谱仪（LC-MS-MS） ThermoTSQ,ESI源、电子天平（美国奥豪斯）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi）、冷冻离心机（德国贝克曼）、研磨仪（德国莱驰）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、棒状均质器（IKA T18）、涡旋混合器（IKA）、氮气浓缩仪(HSC-24A)、固相萃取装置（天津津腾）。
1.2 样品的制备
样品充分搅碎，均质，分出0.5kg作为试样，置于清洁样品容器中，密封，并做上标记。
1.3样品提取
称取5g试样，精确至0.01g置于50mI聚丙烯离心管中，加入10 mL0.6%甲酸溶液，混匀后，置于(47士3) ℃振荡水浴中振摇1h，先加人3 mL 1. 0 mol/L Tris溶液混匀，再加入0.3mL蛋白酶水溶液,充分混匀后，置于(47士3)℃振荡水浴中酶解16-18h。加入20mL0.3mol/L盐酸溶液，振荡5 min，在10℃以5000r/min离心15 min,上清液过滤。
1.4 样品净化
将滤液移人Oasis MAX固相萃取柱中，待样液全部流出后,用30mI乙酸钠一甲醇溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干15min。用3X3 mL二氯甲烷将脱氧卡巴氧洗脱至管内，在45℃用氮气浓缩仪吹干。固相萃取柱再用3 X3mL甲醇、3mL水、3 X3mL0.1 mol/L盐酸溶液和2X3mL甲醇一水溶液分别淋洗，真空抽干15 min，然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，弃去全部淋出液，最后用3 mL甲酸乙酸乙酯溶液洗脱喹噁啉-2-羧酸和3-甲基喹噁啉-2-羧酸到4.3所用试管中，在45℃用氮气浓缩仪吹干。准确加入1.0mL0.1%甲酸一甲醇溶液溶解残渣。过0.2um滤膜,供液相色谱串联质谱仪测定。
1.5 色谱-质谱条件
液相条件：
a) 色谱柱：C18柱，100mm*2.1mm *5um
b) 流动相：A:甲醇 B:0.1%甲酸溶液
质谱条件：
液相色谱-串联质谱仪TSQ QUANTUM ACCESS：配有电喷雾离子；
扫描方式：ESI正离子扫描；
3 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
在ESI源下正离子扫描，根据不同化合物的响应和保留时间差异，确定喷雾电压、碰撞能量、对气流量进行优化，使响应达到最优。
选择反应监测母离子，子离子和碰撞能量见表2；
喷雾电压：4000V；鞘气：40 , 辅助气：10,离子源温度350℃
在同样测定条件下，阳性样品保留时间与标准品保留时间相对偏差在±2.5%之内，各分析化合物参考保留时间见表3；
3.2 线性方程
配置混合标准标准系列工作液，浓度为0，10.0，20.0，50.0，100.0， 00.0ug/L。分别以选定的定量离子峰面积与内标物的峰面积的比值对浓度绘制标准曲线，3种药物在10.0~200ug/L的范围内呈良好线性，r2均大于0.99。
3.3 回收率试验
取同一批阴性样品，加入适量的混合标准液，使加标量在2ug/kg、5 ug/kg和10ug/kg三个浓度，每个浓度做6个平行，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差。
4 结论
试验证明本方法简便、快速、准确,方法的定量下限为2.0 ug/kg，高效液相色谱串联质谱法测定动物组织中卡巴氧代谢物脱氧卡巴氧、喹恶啉-2-羧酸和喹乙醇代谢物3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留量的药物残留的检测方法，达到目前国际上检测该类药物的先进水平,可用于猪肉中脱氧卡巴氧、喹恶啉-2-羧酸和3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留量的确证检测。
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