关于显微镜荧光观察的问题

无论是动态猝灭还是静态猝灭，F0/F与之间均存在着线性关系，单独通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据而没有提供其他信息的情况下，是很难判断所发生的猝灭现象究竟属于动态猝灭还是静态猝灭。通常需要提供猝灭现象与寿命、温度和粘度的关系及吸收光谱的变化情况等信息。

(1) 变温实验 动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时分子的运动加速，其结果将使分子的扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的程度。根据Stern-Volmer方程作图，如果高温的斜率大于低温的斜率，则为动态猝灭；反之，则为静态猝灭。

(2) 测量吸收光谱 动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物质的吸收光谱；而在静态猝灭中，基态配合物的生成往往将引起荧光物质吸收光谱的改变。

(3) 测量荧光寿命 静态猝灭过程中猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命，τ0/τ=1。而动态猝灭，猝灭剂的存在使荧光寿命缩短，τ0/τ=F0/F。区分静态猝灭与动态猝灭最确切的方法是寿命的测定，但由于目前的实验条件所限，荧光寿命的测量一般不易进行。

(4) 比较kq值 荧光分子的平均寿命τ0为10–8 s，根据KSV的值可求出kq的大小，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为2.0×1010 L•mol–1•s–1，如果所求得的kq值远大于2.0×1010 L•mol–1•s–1，则此猝灭过程为静态猝灭过程；反之，则为动态猝灭。