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糖类药物结合液质联用技术的多电荷峰定量

歪果仁zZ

2019/08/19
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私聊

液质联用（LCMS）

糖类药物结合液质联用技术的多电荷峰定量
摘要
低分子肝素(LMWHs)是由未分离肝素化学或酶法解聚制备的非均相、高负电荷的多糖，作为抗凝药物及治疗、预防血栓栓塞已被广泛应用，最近，LMWHs在癌症、糖尿病和老年痴呆等疾病中的潜在应用也有报道。然而，由于结构的复杂性，它们的药代动力学特征还没有得到充分的研究，目前基于抗凝血活性测定的药代动力学参数并不能真正衡量肝素在血液循环中的情况（因其仅仅考虑到肝素与凝血相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂的相互作用，而忽略了肝素与其他血浆蛋白、内皮细胞、血细胞和血小板的相互作用，因此，抗凝血试验对药代动力学参数的估计可能是错误的，剂量-疗效曲线亦不能充分显示），对于这类药物，由于采用的检测方法不同，药动学检测的结果是不一样的，即与检测方法有关的药动学，因此建立体内高灵敏分析方法进而探明糖类药物的药代动力学过程对其进一步的开发应用和临床合理用药具有重要的意义。
前言
目前用于LMWHs定量分析的最常用策略是自底向上方法。在这种方法中，LWMHs首先被heparinasesI, II, III酶切成二糖单元,采用各种分离技术如强阴离子交换色谱法(SAX),反相离子对色谱法(RPIP)和毛细管电泳(CE)及液质连用（LC-MS）技术等进行定量分析，但是二糖的分析并不能充分表明多糖在体内的药代动力学过程。
另一种用于LMWHs分析的策略是自顶向下的方法，在这种方法中，完整的寡糖链无需事先酶解就可以直接分析，利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)产生多电荷峰，可扩大检测的分子质量范围并提高灵敏度，其MRM模式已成功运用于蛋白和多肽类药物的定量。目前开发的尺寸排除色谱质谱联用(SEC-MS)、RPIP-LC-MS、HILIC-LC-MS等方法，对LMWHs进行了比较详尽的表征。本文拟采用相似的液质联用多电荷峰策略应用于多糖类药物的含量测定。
依诺肝素，最常用的低分子肝素，由未分级肝素化学β消除裂解产生，重均分子量在3500-5500Da,在针对肝素类药物的方法开发研究中，常被作为一种模式分子应用在方法开发阶段，若本方法可以将其成功定量，则可间接说明本方法具有分析糖胺聚糖类药物的潜能。参考文献得到依诺肝素的SEC-MS指纹图谱如下图1，以dp16为例，经专业软件处理后（图2）得到结构组成（图3）及相对比例（图4）。

图1

图2

图3

图4
实验过程
经汇总多篇文献得到的分子量及不同电荷状态的分子量如表示（未放全），dp代表聚合度，dp4即四个单糖的聚合，-2代表多电荷状态，表示带2个负电荷，其值有(m/z-nH⁺)/n算出。颜色标识处为重复的分子量。
仪器与试剂
使用MIM（Q1=Q3）模式并根据保留时间顺序确定聚合程度（在HILIC柱上聚合度越高保留时间越靠后）筛选响应高的电荷状态，将筛选的离子作母离子在负离子模式下进行MRM条件摸索，所用仪器为：
API 4000型三重四级杆串联质谱仪，美国 AppliedBiosystem Sciex 公司
美国AglientTechnology公司1260型液相色谱仪，包括：G1312B二元泵，G1322A 在线脱气机，G1316A 柱温箱；日本SHISEIDO 公司NASCA F5100型自动进样器。色谱柱：Luna 3um HILIC 200 A，流动相：A 5mM NH4Ac-水，B 5mM NH4Ac-乙腈，梯度洗脱：0-40min，5%-35% A，流速：300ul/min
实验结果
进行质谱条件摸索时，发现子离子较多较乱，无法确定特征子离子，决定采用磺达肝癸纳这个纯品五糖分子作为模式分子同样在HILIC柱上进行MRM条件及液相条件摸索，磺达肝癸纳信息如图5：

图5 磺达肝癸纳分子式
液相及质谱条件及色谱峰结果：流动相：A 5mM NH4Ac-水，B 5mM NH4Ac-乙腈。等度洗脱：0-7min，55% A。流速：300ul/min
图6 磺达肝癸纳液质色谱峰
由磺达肝癸钠启示，母离子减掉SO₃作为子离子非常特征因而响应比其他碎片离子响应高，那么依诺肝素子离子的MRM条件摸索可以考虑减掉SO₃后的碎片离子做子离子，但依此摸出的依诺肝素MRM条件部分离子虽特征（保留时间可以对上）但响应极差（小于1*e⁴），仅可作为定性使用，认为磺达肝癸钠的摸出的特征子离子模式不适合依诺肝素作参考。随后摸MRM条件时选择了响应较高的子离子，不特征（峰分不开，因计算多电荷分子量时有重复数据）但响应较高，如图7，采用母离子减掉SO₃作为子离子的模式对每个峰定性，发现18-24min为dp4，22-28min为dp6，如图8，这与之前MIM 模式根据保留时间推出来的寡糖单元相吻合，dp8可忽略不计。

图7 选择响应较高碎片作子离子的部分色谱图

图8 采用特征子离子定性保留时间的色谱图
部分分子量即使选择了响应较高的子离子，但在色谱图上响应依然很低，推测是因为体系太复杂，产生了相互影响，这类分子量只能选择MIM模式定量，将时间缩短后总结得出的结果如下：色谱柱：Luna 3um HILIC200 A，流动相：A 5mM NH4Ac-水，B 5mM NH4Ac-乙腈，梯度洗脱：0-25min，5%-35% A，流速：300ul/min，进样量：10ul，浓度：1mg/ml

图9 依诺肝素筛选出的分子量色谱图

图10依诺肝素筛选出的分子量色谱图
结论
得出的结果响应和浓度成正比，但进样总浓度太大，尽管每一个分子量可能占比较小，但仍不适合体内的痕量分析，MIM模式基线较高，峰较宽，推测由同一分子量的太多导致的，这种情况下峰面积积分时会产生较大误差，即使改进色谱条件使峰剧烈冲出，MIM模式在在操作过程中也极易中受到污染，经综合考虑后，决定这一实验思路不可行，或者这类药物的性质决定了不适合采用这种方法定量，本以为这种方法可以尝试一下做多糖药物代谢的。

分
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