【第十二届原创】高效亲和色谱法检测乳制品中乳铁蛋白的含量

乳铁蛋白（Lactoferrin）是乳清蛋白的主要成分之一，广泛分布在人和哺乳动物的乳汁中，是母乳中的核心免疫蛋白，能够帮助婴幼儿提高免疫力，促进婴幼儿的生长发育。因此，添加乳铁蛋白的婴幼儿奶粉越来越受到消费者的青睐，食品安全国家标准-食品营养强化剂-乳铁蛋白（GB1903.17—2016）也将乳铁蛋白列为营养强化剂之中，但该标准中的检测方法未经前处理，检测方法受杂质干扰大。我们自制的SelectCore Heparin肝素亲和SPE柱，可以快速高效的检测乳铁蛋白含量。

该方法适用于测定婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米粉、调制奶粉、发酵乳等食品中乳铁蛋白含量。

实验步骤

1、试剂准备

磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取14.2 g磷酸氢二钠，加水溶解，用磷酸调节pH值至8.00±0.50，加水定容至500 mL。

磷酸氢二钠-氯化钠溶液：称取0.71 g磷酸氢二钠，5.84 g氯化钠，用磷酸调节pH值至8.00±0.50，加水定容至100 mL。

乳铁蛋白标准品：乳铁蛋白母液，浓度10 mg/mL，称取1 g乳铁蛋白加水溶解，定容至100 mL。

2、样品制备

液体试样：准确称取5 g试样于50mL离心管中，加入5 mL磷酸氢二钠溶液，涡旋震荡0.5 min，4 °C下以10000 r/min的转速离心10 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复一次，合并两次上清液备用。

固体试样：准确称取1 g试样于50 mL烧杯中，加入5 mL温热的磷酸氢二钠溶液（温度不超过50 °C），搅拌使样品完全溶解，将样品全部转入50 mL离心管中。再向原烧杯加入5 mL磷酸氢二钠溶液，合并两次液体，涡旋震荡0.5 min，4 °C下以10000 r/min的转速离心10 min，将上清液转移到另一50 mL离心管中。再加入5 mL磷酸氢二钠溶液重复一次，合并两次上清液备用。

3、净化

SPE柱活化：SelectCore Heparin，规格1mL小柱加入5 mL磷酸氢二钠溶液活化；

上样：加入步骤2中制备好的上清液；

淋洗：待上清液完全流出后，再用10 mL磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部淋洗液；

洗脱：用2.5 mL磷酸氢二钠-氯化钠溶液洗脱，收集全部洗脱液，用磷酸氢二钠-氯化钠溶液定容至2.5 mL。将收集溶液过滤膜，供液相色谱分析。

4、液相色谱仪器条件

色谱柱：ChromCore C4-T，5μm，300A，250mm×4.6mm

检测波长：280nm

柱温：30 °C

进样体积：20 μL

流速：1.0 mL/min

流动相：A相：0.1%三氟乙酸水溶液；B相：乙腈

洗脱梯度：

图1 婴幼儿奶粉未经净化和净化后的色谱对比图

图1显示，未经净化处理的婴幼儿奶粉受基质效应影响较大，并且目标峰和杂质峰的分离度较差，净化处理的婴幼儿奶粉基线稳定，并且目标物质清晰可见。

实验谱图及加标回收率数据

实验谱图：

图2 0.2mg/mL乳铁蛋白标准品色谱图

图3 婴幼儿奶粉加标（加标量：10mg/100g）色谱图

图4 婴幼儿奶粉加标（加标量：50mg/100g）色谱图

加标回收率数据：

由以上谱图可以看出，婴幼儿奶粉的加标回收率较好，符合检测要求。

实验讨论

1. 相比市面上常见的琼脂糖基质的肝素亲和小柱，纳谱分析采用单分散聚丙烯酸酯基质开发的肝素亲和小柱滴速更快，相同装量下滴速可以快1~2倍，加快了前处理的时间；

2. 试验操作的时候，即使小柱流干也无需担忧，我们采用的单分散聚丙烯酸酯基质，机械强度高、化学稳定性好，即使小柱流干再次润湿也同样保证回收率。