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原创-非洲猪瘟自检实验室试剂选择参考

栀子花开

2019/09/10
分析者端木花之队

原创-非洲猪瘟自检实验室试剂选择参考

非洲猪瘟自检实验室，指的是屠宰场、食品加工企业、种猪场、规模猪场，在国家有关部门要求下，建立的以非洲猪瘟病毒核酸检测为主的微型实验室。这些实验室以前大多没有分子生物学检测基础和经验，对于如何选择试剂心中无数。下面提供一些选择试剂的看法，供参考：
一、抗凝剂
非洲猪瘟病毒核酸检测，对于屠宰场和种猪场、规模猪场来说，样品一般选择EDTA抗凝血。
对于种猪场和规模猪场来说，采样量不大，推荐采购EDTA抗凝管。
对于屠宰场来说，采购抗凝管确实方便，但也确实不便宜。农业农村部要求屠宰场采血做到全覆盖，试想一下：每支EDTA抗凝管成本约1元，屠宰场每天屠宰1000头，一年的抗凝管成本就是36万元。因此，在屠宰场看来，抗凝管是“想说爱你不容易”。在控制成本的策略下，自行配制抗凝剂成为不二之选。
一般认为，1.5mg EDTA钠盐可以阻止1mL血液凝固。因此，每1mL血液需要用15 mg/mL EDTA钠盐溶液0.1mL。
配制方法：(1)首先配制生理盐水溶液：取8.5g氯化钠，溶于1000mL纯水中；(2)配制EDTA溶液：取EDTA钠盐15g，溶于1000mL生理盐水溶液中，此时EDTA浓度为15mg/mL；(3)用法：取EDTA溶液0.1mL，置于塑料离心管或其它容器中，倾斜放置于37℃至45℃烘箱中烘干备用，可抗凝1mL以内的血液。
使用方法：采血后立即将血液注入该离心管中，颠倒数次后混匀待用。如需抗凝更多血液，可按比例增加EDTA溶液用量。
二、提取及扩增试剂
1、提取试剂
目前自检实验室普遍采用所谓的免提试剂盒，但站在专业的角度看，所谓的免提实际上是粗提，只不过省略了洗涤的过程。在此情况下，稀释核酸的试剂难免会对后续的扩增起到抑制作用。据报道，在不考虑试剂盒其他因素影响的情况下，提取核酸（也就是经过洗涤步骤）比免提取核酸（也就是未经洗涤步骤）灵敏度高10-100倍，反映到Ct值上，提取核酸比免提约低3-7左右。
众所周知，屠宰场的待宰生猪，绝大多数是健康的。即便少数带毒，病毒量也极少。加上屠宰场采取混样检测，每个来源的生猪往往混成一份样品，有时混样比例甚至达到1:50。在此情况下，待检样品即使有病毒，其病毒核酸含量也被稀释得极低。如果再采用免提试剂盒，检测效果可想而知。
综上，个人认为对于屠宰场，包括种猪场和规模猪场假定健康情况下，推荐采用核酸提取试剂盒，对于免提试剂盒应该慎用。
2、扩增试剂
目前荧光定量PCR扩增试剂已经非常成熟，一般的扩增试剂盒或者预混液，直接用于检测都能取得理想效果。因此，对于扩增试剂不需要过于纠结，选用推荐产品即可。
3、引物探针及阳性对照
在初步开放检测权限时，采用了“引物探针+提取试剂+扩增试剂”的模式，取得了不错的效果。在公布第二批试剂推荐名单前，多数实验室也是采用这种模式开展检测，包括参加各种比对试验。但遗憾的是，公布第二批名单后，引物探针及阳性对照不再供应，多数实验室也只能采购推荐名单产品。
需要指出的是：目前市场上独立的DNA提取试剂盒，每个检测的成本约15元；通用的荧光定量预混液，每个检测的成本约10元；引物探针及阳性对照假设每个检测的成本为5元；合计每个样品提取及扩增的成本仅30元。而目前市场上非洲猪瘟检测试剂盒，供应价基本上每个检测在50-70元之间，无形之中增加了屠宰场及相关主体的经营成本。要知道，一个再小的屠宰场每天的检测量也有20份左右，每年增加的成本20份/天*360天*（20-40）元/份=（14.4-28.8）万元。
基于此，强烈建议农业农村部考虑经济主体的经济承担能力，公布引物探针序列，并安排有关单位无偿或有偿供应阳性对照。
三、消毒剂
对于非洲猪瘟检测环境来说，极细小的污染都会造成实验结果的失败，甚至可能引起病毒扩散，因此做好消毒工作非常重要。
对于非洲猪瘟来说，比较有效的消毒剂是0.8%氢氧化钠或氢氧化钾溶液。配制方法比较简单，取8g氢氧化钠或氢氧化钾溶于水即可。需要注意的是，一次不能配制太多，最好几天内用完。而且配制好的溶液，应贮存于密封的塑料喷壶或塑料瓶内，随用随取。
四、灭菌指示剂
按照规定，非洲猪瘟检测剩余样品、检测产物及废弃物等，均需经高压灭菌后进行无害化处理。灭菌效果是否达到要求，是一个不容忽视的问题。
灭菌效果监测包括物理监测、化学监测和生物监测。
物理监测：每次灭菌时观察温度、压力和时间等灭菌参数是否符合要求。温度波动范围在+3℃以内，时间满足最低灭菌时间的要求。
化学监测：每次灭菌时，取一片灭菌指示卡或灭菌指示胶带，随同灭菌物品一同放入灭菌器，待灭菌结束后观察是否按规定变色。
生物监测：每隔一段时间，应进行高压灭菌器生物监测，取嗜热脂肪肝菌芽胞菌片按规定程序灭菌，结束后在无菌条件下取出标准试验包的指示菌片，投入溴甲粉紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，经56℃±1℃培养7d，观察培养结果。生化监测要求较高，涉及微生物实验操作，自检实验室可委托相关单位开展检测。

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小不董

第1楼2019/09/11

应助达人

这试剂费用不低啊。
问下花老师，我们买来猪肉也用碱洗下是不是更好？
高温能杀死吗？

0

栀子花开

第2楼2019/09/11

应助达人

不需要特殊处理，对人没有危害

0

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