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【金秋计划】8个引物设计秘诀，PCR成功率直线飙升

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2024/09/06

大家在构建质粒时，是不是经常会出现PCR产物太少，出现非特异性产物，以及酶切总是切不开等问题，其实，构建质粒不成功，绝大原因出在引物设计的问题。
设计秘诀1：长度。
一般引物长度为18-30bp，通常20bp左右最为常用。上下游引物的长度要一致。引物过短，会导致非特异性扩增；引物过长，会形成发卡结构。
设计秘诀2：GC含量。
引物的GC含量一般为40-60%，G+C含量太低扩增效果不佳，G+C含量过高会出现非特异条带。
设计秘诀3：Tm值。
熔解温度（Tm）是指在特定条件下，DNA引物双链解链成为单链的中点温度。Tm值对于PCR反应的退火步骤至关重要，直接影响引物与目标DNA的结合效率。
对于短链引物的Tm值计算公式可简化为：Tm=2×（A+T）+4×（G+C）。
因此，一般引物的Tm值为55-75℃，且退火温度需要比解链温度要低5℃。
设计秘诀4：扩增跨度。
普通PCR以200-500bp为宜，实时荧光PCR则为70-150 bp。
设计秘诀5：二级结构。
引物设计最好跨内含子设计，避免出现发卡结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响。
设计秘诀6：确保碱基随机分布。
引物设计中四种碱基的分布应保证随机性，有助于提高引物的合成效率和扩增的特异性，应避免设计包含5个或更多连续相同碱基的引物，如AAAAAAAA或CCCCCCCC。
设计秘诀7：确保引物自身/之间没有连续4个碱基的互补。
避免引物自身或引物之间出现连续4个碱基的互补是非常重要的。单个引物不应在其序列内部形成互补，这会导致引物出现发卡结构，从而降低可用于扩增的引物浓度。上下游引物之间也不应存在连续4个碱基以上的互补，防止形成引物二聚体。
设计秘诀8：5'端可修饰，3'端不可修饰。
5'端修饰：
①标记与检测：在5'端添加荧光标记或其他标签，便于扩增子的检测和分析。
②引入限制性酶切位点：为了将扩增的片段克隆到特定的载体中，需要在5'端添加限制性酶切位点序列，此外，不要忘了添加保护碱基哦。
③增加引物的Tm：通过在5'端添加G或C碱基，可以提高引物的Tm值，有助于提高PCR的特异性。
④提高引物的溶解度：在5'端添加一些非特异性的序列，可以提高引物在水中的溶解度。
3'端不可修饰：
可能会影响DNA聚合酶的延伸效率；增加非特异性扩增；影响引物的特异性。

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