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HRP标记的二抗能做免疫荧光吗?
Ins_bf0c01c3
2024/01/29
私聊
生命科学仪器综合讨论
免疫组织化学
(
IHC
)是一种实验技术,通过使用一抗来检测组织切片中细胞内的蛋白质(抗原)。在间接检测法中,一抗常与辣根过氧化物酶(
HRP
)偶联的二抗结合。最后,利用如
DAB
等底物来显现染色,以可视化抗原的存在。
HRP
辣根过氧化物酶标记的二抗通常用于如免疫印迹、酶联免疫吸附试验以及免疫组织化学等应用。然而,对于免疫荧光而言,二抗需要带有在激发光下激发的荧光基团,常用的标记物为异硫氰酸荧光素
(FITC)
和罗明达
B200(RB200)
标记的抗体。
因此,
HRP
标记的二抗不能直接用于免疫荧光。
使用
HRP
二抗时,优化
IHC
实验的简便技巧
:
①选择合适的
HRP
二抗
务必确保
HRP
二抗与一抗的相容性。举个例子,如果一抗在兔体内制备,则应使用抗兔
HRP
二抗。如需了解更多技巧,请查看我们的二抗选择指南。
②在
IHC
染色过程中,如何选择
HRP
二抗的初始稀释度?
HRP
二抗的最佳稀释度取决于一抗。我们建议在
1/1,000
至
1/100,000
这一范围内进行试滴定。
③对于
HRP
标记的二抗,建议使用哪种缓冲液?
可使用含
TBS
的
1% BSA
。
Abcam
建议使用
TBS
,因为
TBS
的背景比
PBS
更干净。如果仍然遇到高背景染色,您可以增加
BSA
浓度或使用含
5%
牛奶的
TBS
。
请注意,二抗可能与组织中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。用二抗种属的普通血清预处理组织,可最大限度地减少交叉反应。一抗孵育前,使用普通血清进行封闭还可避免
Fc
受体与一抗和二抗的结合。加入
BSA
能够减少疏水作用引起的非特异性结合。
④是否需要预吸附二抗?
预吸附二抗可减少非特异性背景,因为它们不太可能表现出种属交叉反应性,或与预吸附种属的内源性抗原反应。二抗应针对样本来源种属进行预吸附。例如,对人体组织或细胞进行染色时,建议使用预先吸附了抗人血清的
HRP
二抗。
⑤什么是证明二抗特异性染色的良好对照?
为了证明二抗与一抗发生特异性反应,我们建议进行对照试验,即添加不含一抗的
HRP
二抗。如果在对照样本中观察到染色,则结果表明
HRP
二抗与组织上的内源性免疫球蛋白发生非特异性反应。
⑥孵育时间
室温孵育
1
小时即可。如果信号较弱,可于
4
°
C
孵育过夜。
更多详情可以查看优质
二抗
列表页:
https://cn.sinobiological.com/category/secondary-antibodies-list
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