1、溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差
2、梯度混合的溶剂互溶性要好
3、梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）
4、注意查看空白实验（梯度）的数据（杂峰等）。
5、遵守分析周期，每次梯度结束后要等待一段时间使系统（流动相）回到初始状态并稳定，再进行下一次分析。

梯度时可先进一个空白针，再进样

应助达人

1、管路及柱子做梯度前要彻底的冲洗干净，防止空白中过多鬼峰的出现。
2、溶剂最好都用色谱纯的，特别是最好用高纯水或双蒸水，防止梯度分析中基 线过大的漂移。
3、要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。
4、梯度分析中有机相的陡度不要太大。

我们都是高压梯度，梯度洗脱得注意：
1.溶剂的互溶性,当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，特别是磷酸盐;
2.切底脱气，溶剂相混可能产生气泡
3.溶剂比例变化引起粘度变化而产生压力变化，注意压力限
4.每次梯度洗脱完要进行足够的平衡，使其恢复初始状态
5.因为几相溶剂的混合，很容易产生鬼峰，空白得多做几次，使两次的空白重合为止，我一般要做3次

脱气问题处理好， 其他都好处理

最好有在线脱气机，这样溶剂混合时少了很多说不清的东东，再有就是尽量选用变化缓慢的梯度，否则你的基线就很难看，就是空白也不一定能完全扣除，特别是用面积归一法时，基线就特别重要，要不里面有什么东东就不知道了，监测器尽量用DAD吧，可以看里面的峰的纯度！

我们在做梯度洗脱时一般都会注意以下几点
1、混合的溶剂互溶性一定要好，否则产生气泡或者不溶，或者结晶都不好。
2、溶剂都尽量选色谱纯。像磷酸我们都是用色谱纯的。
3、一般都要进一针空白溶剂。能清楚了解产生的峰到底是不是由样品产生还是溶剂产生。
4.有时我们会让几个条件都分别平衡系统。
5、每次梯度结束后要等待一段时间使系统（流动相）回到初始状态并稳定，再进行下一次分析。

我们基本只用梯度洗脱，决定比较烦人的就是基线比较难走平，其他还好，

高手，其实我基本都是用梯度洗脱，很少用等度

高压梯度也会产生气泡吗?空白用做3次吗？我觉得开始多做几次，情况都清楚后，1次就够了，否则太浪费时间。