农药残留检验方法系列讲座（43）HPLC测动物组织中苯并咪唑类兽药残留


反相高效液相色谱法同时测定动物组织中

苯并咪唑类兽药残留量





摘要

本文建立了高灵敏度的苯并咪唑的测定方法，通过对实验条件的优化，采用反相高效液相色谱法同时测定动物组织中的苯亚砜苯咪唑(oxfendazole)、噻苯咪唑酯(cambendazole)、丙苯咪唑(albendazole)及苯硫达唑(fenbendazole)4种苯并咪唑类兽药残留量。测定方法的相关系数r>0.9999，检出限为0.01mg/kg,，线性范围为0.05-10.0mg/L，精密度为2.1%-7.3%，回收率为74.8%-90.2%。



本文由广州出入境检验检疫局的陈毓芳和广东出入境检验检疫局彭肖颜两位研究人员共同完成的，下面全文介绍如下：



1 前言

苯并咪唑类作为兽药主要用于动物的驱虫药，广泛应用于兽医临床上。对动物源食品中苯并咪唑类兽药残留量检测和监控，已列入《中华人民共和国及动物源食品残留监控计划》,以确保我国动物源食品的安全卫生，保证人民的身体健康，增强我国动物源食品在国际上的竞争力。分析苯并咪唑类残留含量的方法主要是高效液相色谱法[1-3]，用梯度洗脱分离多个组分[1]，或等梯度洗脱法分离测定某单一成分[2]，用荧光或紫外检测器检测。一般都不同程度地存在萃取、净化等繁琐的样品前处理，被测组分损失较大及梯度洗脱法测定时基线易漂移影响测定结果等缺点。本文采用高压混合泵和二极管阵列检测器(PDA)，用等梯度洗脱法成功地分离和测定了4种苯并咪唑残留含量，优化了样品前处理条件，方法简便、快速，检出限低，精密度好，回收率高，结果令人满意，可广泛应用于动物组织中的苯并咪唑类残留含量的检测和监控。



2 实验部分

2.1 仪器与色谱条件

2.1.1 主要仪器

LC-10AD系列高效液相色谱仪，LC-10AD泵，SIL-10A自动进样器，CTO-10A柱温箱(均为日本岛津公司)；Waters 996二极管阵列检测器，WatersMillenium32色谱数据系统；ZYMARK水浴氮气吹干浓缩机。

2.1.2 色谱条件

色谱柱：DiscoveryC18,250×4.6mm，5μm；保护柱：DiscoveryC18，20×4.0mm,5μm。柱温32℃，流动相中甲醇：KH2PO4(0.02mol/L，pH7.0)=65:35，流速1.0mL/min，检测波长294nm及316nm，进样体积20μL。



2.2 试剂与试样

2.2.1 试剂

甲醇为色谱纯,磷酸、磷酸二氢钾为优级纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2.2.2 标准药品

苯亚砜咪唑、噻苯咪唑酯、丙苯咪唑、苯硫达唑为SIGMA公司提供，纯度分别为99.6%、

98.7%、99.5%、99.0%。



2.3 标准溶液

标准贮备液:：准确称取10.0mg苯并咪唑的各标准品，分别溶于100mL甲醇中，制得单个的100mg/L的标准贮备液，在4℃下保存，每月新配一次。

中间标准液:：取5mL贮备液用50mL甲醇稀释,制得10mg/L单个的中间标准溶液。同时还制备10mg/L的混合标准溶液。在4℃下保存,每半个月新配一次。

标准使用液:：取中间标准液配制适当浓度的混合标准使用液，4℃下保存，每周新配一次。



2.4 样品处理及样液制备

将动物组织解冻，准确称取10g置于50mL具塞三角瓶中，按顺序加入1mL4mol/L的碳酸钾溶液、25mL乙酸乙酯，盖上塞子，在旋涡混合器上旋混30s，置于超声波振荡机上振摇20min。以3000r/min高速离心3min，取上清液,通过加有30g无水硫酸钠(已灼烧过)的滤纸过滤到浓缩瓶中。离心后的残渣用同一方法提取两次，提取液一并加入到浓缩瓶中。于55℃水浴中用微缓氮气吹干。加2mL正己烷到吹干的浓缩瓶中溶解残渣,在旋涡混合器上振荡溶解残渣，并将溶液转移到5mL离心管中，再加2mL甲醇-1mol/L磷酸溶液(1:1)到浓缩瓶中，合并溶液到离心管内，充分旋混。以3500r/min的速度离心3min。弃掉上层正己烷，再向浓缩瓶中加入2mL正己烷清洗，洗液加入离心管中重复上述操作至下层溶液澄清。取下层溶液过滤后上机测定。用外标法/峰面积定量。



3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 流动相

根据仪器条件，利用甲醇和磷酸二氢钾缓冲液,，按不同配比进行了二元等梯度洗脱的研究，结果表明采用甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(65+35)，4种标准品在14min内均可达到基线分离，分离度R>1.5，峰纯度好和峰形对称。达到柱效高、分离度佳、峰纯度好、色谱峰对称、分析时间尽可能短等要求，选用该系统为最佳流动相体系。

3.1.2 流速

流速影响苯并咪唑标准品的分离。流速过快，色谱峰重叠,且柱压升高，不利于分离;流速过慢，又会延长分离时间，降低分离效率。经试验,选择流速1.0mL/min为宜。

3.1.3 柱温

温度的变化可以引起保留时间的改变。保持恒定的柱温,有利于峰位的重现性。实验证实，柱温选择在32℃时，实验结果重现性好，各标准品的保留时间tR的相对标准偏差为0.39%-0.47%(n=7)；分离度R最佳为2.0-9.3。

3.1.4 检测波长

标准光谱图都有两个最大吸收波长(见图1)。220nm附近吸收最大，但因甲醇在短波长吸收较大，故选择294nm作为苯亚砜苯咪唑、丙苯咪唑、苯硫达唑的分析波长，314.5nm作为噻苯咪唑酯的分析波长。




3.1.5 检测器

采用二极管阵列检测器分析效果较佳，如用Waters996二极管阵列检测器，方法检出限为0.01mg/kg，不但可选择双波长进行分析，提高灵敏度,还可通过光谱图来确证可疑峰，增加准确度。



3.2 样品前处理

由于被测定的残留物具有弱碱性，这性质可利用来进行有效的提取和净化。动物组织样品用碳酸钾碱化,再用乙酸乙酯提取，残留物在甲醇-磷酸溶液和己烷之间进行分配，除去油脂。用甲醇-磷酸溶液定容，既可用正己烷除脂，又可使苯并咪唑残留物很好地溶解于甲醇-磷酸溶液层。甲醇在磷酸溶液中几乎不与正己烷互溶,且溶液测定时不会形成负峰，所以待测样液用甲醇-磷酸溶液定容。简化了文献[1]报道的复杂的萃取反萃取过程，提高了回收率。



3.3 标准样品色谱图

图2为标准样品色谱图。各标准品的保留时间为：苯亚砜苯咪唑4.669min,噻苯咪唑酯5.588min、丙苯咪唑10.095min、苯硫达唑13.471min。



3.4 方法的线性范围和检出限

用混合中间标准溶液配制0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/mL的混合标准液。将不同浓度的标准溶液在上述选定的色谱条件下分别进行测定，进样体积为20μL。以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标绘制校准曲线。实验结果表明,各标准品的浓度在0.05-10.0mg/L的范围内，浓度与其峰面积呈良好的线性关系(如图3)，线性回归方程分别为：

苯亚砜苯咪唑:A=6.695466×104C-2.099328×102 r=0.99993;

噻苯咪唑酯:A=8.918677×104C+1.156670×103 r=0.99998;

丙苯咪唑:A=5.095955×104C+1.035631×103 r=0.99995;n

苯硫达唑:A=5.922077×104C-4.936883×102 r=0.99995。

各标样的方法检出限为0.01mg/kg(信噪比>2)。



3.5 精密度和准确度

表1为动物肾脏样品中定量分析的实验数据。在空白(未检出)的样品中加入不同量的苯并咪





4 结论

本文研究了反相高效液相色谱法测定动物体组织中的苯并咪唑类兽药残留量的条件。研究结果表明，以甲醇L缓冲溶液=65L35作流动相，在MN=7.0的条件下，这4种组分可以达到基线分离。根据这4种组分的光谱图,确定其最大检测波长为294及314.5Om(双通道)。该方法线性范围较宽，检出限低，重现性好，精密度高，可同时测定可食性动物组织中的苯亚砜苯咪唑(（Oxfendazole）噻苯咪唑酯（cambendazole）丙苯咪唑（albendazole）和苯硫达唑（fenbendazole）4种苯并咪唑类兽药残留量。



参考文献

[1]、中华人民共和国国家进出口商品检验局《食品分析大全》编写组编，食品分析大全[M],第1卷，北京：高等教育出版社，1997，884-886.

[2]、中华人民共和国农业部，兽药及其他化学物质在动物可食性组织中残留检测方法[M]，1998，17：1-5，60-63.

[3]、Marti A M, Mooser A E Koch H，.肉样中苯并咪唑的测定方法[j].j.Chromatogr.,1990，498：145-157.

农药残留检验方法系列讲座（44）河水中百草枯和敌草快的SPE和LC-MS分析方法


河水中百草枯和敌草快的SPE和LC-MS分析方法



前 言

季胺类化合物百草枯和敌草快是一类大量使用的农药。据USGS1997年的估算，除草剂百草枯的使用量超过3,000,000磅 ，敌草快的使用量超过200,000磅。百草枯和敌草快属季铵盐类物质(其结构如图1所示)极性较强。使用反相色谱提取和分析时，需要使用离子对试剂达到保留和分离的目的。




图1：百草枯和敌草快的结构图



Oasis® WCX是Waters公司推出的新型弱阳离子交换和反相双重机理SPE填料，对强碱性化合物有其独特的保留和提取能力。与强阳离子交换和反相双重机理SPE填料(如Oasis® MCX)相比，Oasis® WCX更适合于极性较强的碱性化合物提取，且提取过程中使用的洗脱溶剂亦更适合于质谱分析。本文采用Oasis® WCX对百草枯及其相关化合物进行提取，获得了良好的结果。



本工作由Waters公司的Michael S. Young and Kevin M. Jenkins所完成，他们

为使液相色谱条件更适合质谱检测条件，采用了具有亲水相互作用机理(HILIC)的Atlantis® HILIC色谱柱进行HPLC分离。HILIC色谱柱的分离具有与反相色谱不同的选择性，与质谱兼容的流动相，非常适合强碱性、极性化合物的分离与分析。全文介绍如下。



实验条件

仪器：Waters Alliance® 2695分离单元，带柱温箱和样品控温系统，Waters/Micro- mass Quattro Micro™三重四极杆质谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器。



样品制备

向20mL河水样品逐滴加入1M磷酸铵缓冲液，调节pH为7。



固相提取

1. 分别使用1mL甲醇和1mL水活化和平衡Oasis® WCX 固相提取小柱(3cc/60mg Oasis® WCX )

2. 将20mL经过处理的河水样品上样至小柱

3. 分别用1mL 1M pH7的磷酸盐缓冲液，1mL水和1mL甲醇清洗小柱

4. 用1.5 mL乙腈∶水∶三氟乙酸( 84:14:2)混合溶液洗脱目标组分

5. 用流动相定容至0.5mL，待用



图2：0.5µg/L百草枯和敌草快在Atlantis® HILIC色谱柱上分离的LC-MS谱图。右侧插入图谱为HILIC法与离子对-反相色谱分离法的LC-MS响应值的对比结果。



液相色谱条件

色谱柱：Atlantis® HILIC, 2.1 × l 50 mm, 3.5 µm

流动相：乙腈∶250mM甲酸铵缓冲液，pH3.7（40∶60）

流速：0.4 mL/min

进样体积：20µ L

柱温：30 °C



用于LC-UV分析的色谱柱：Atlantis dC18, 2.1× 150mm, 3.5 µm

流动相：乙腈∶0.1%七氟丁酸水溶液（25∶75）

流速：0.3 mL/min

进样体积：20µ L

柱温：30 °C



质谱分析条件

表1 百草枯和敌草快的质谱分析条件



结果和讨论

20mL河水样品的分析结果显示，被测组分在0.1 - 10 µg/L的范围内呈良好的线性。定量限低于0.2µg/L。图2为0.5µg/L空白加标样品的色谱图。



配制一系列1µg/L(1 ppb)的空白加标样品，每份样品一天内重复进样5次，连续5天进样。实验结果见表2。



表2：空白河水加标样品（浓度1.0µg/L）日内分析结果



由图2可见，LC-MS的分析结果灵敏度更高(见图2右侧的HILIC与离子对色谱法分析的比较图)，更适合于此分析。而相同的Oasis® WCX固相提取方法也适合离子对-反相液相色谱分析。图3展示了使用离子对试剂时，0.5µg/L的空白加标样品在Atlantis® dC18柱上的反相色谱分离结果。然而，流动相中使用的离子对试剂与高灵敏度的LC-MS分析不兼容。



使用新型Oasis® WCX吸附剂和Atlantis® HILIC分析柱以及LC-MS，只需20mL的样品，百草枯的定量限低于100 ng/L (ppt)。而原有的方法则需要更大体积的样品，且仅适合于LC-UV检测。



图3：0.5µg/L百草枯和敌草快在Atlantis® dC18色谱柱上分离的LC-UV色谱图。流动相中含有0.1%七氟丁酸水溶液作为离子对试剂。

农药残留检验方法系列讲座（45）SPE-HPLC测蔬菜-水果中氨基甲酸酯及其代谢物


固相萃取-高效液相色谱法测定

蔬菜、水果中的氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物残留



摘要： 本文采用乙腈提取、固相萃取浓缩、高效液相色谱分离、柱后衍生．荧光检测法测定了蔬菜、水果中8种氨基甲酸醋类杀虫剂及其代谢物残留量。氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物加标平均回收率为70％～120％，相对标准偏差(RSD)小于20％ (n=3)，最低检出限范围为0.0042～0.0106mg/kg。



一、前言

氨基甲酸酯农药是目前我国使用量较大的杀虫剂之一，主要应用于粮食、蔬菜和水果上。目前我国应用于果蔬上氨基甲酸酯农药残留检测的方法分为化学法和生物法两大类。化学法多采用传统的液-液萃取和柱色谱净化前处理技术，用气相色谱法（GC）或高效液相色谱法(HPLC)测定。由于氨基甲酸酯农药一般缺乏热稳定性，在进行GC测定时会造成分解，同时也缺乏灵敏度高的选择性检测器，因此，除对化合物直接测定 ⑴ 外，较多的方法是先将农药衍生为适于电子捕获检测器检测的衍生物⑵ 再进行定量测定；高效液相色谱法常用的检测器是紫外检测器，但灵敏度不高 ⑶；荧光检测器因具有高灵敏度已被用于氨基甲酸酯残留农药的检测 ⑷。生物法包括酶联免疫法和快速酶法⑸，简单快速，易操作，但检测的果蔬和农药品种有限。



本文由农业部环境保护科研监测所的刘长武、刘潇威、翟广书、刘凤枝、买光熙、陈勇和王一茹等研究人员采用固相萃取、柱后衍生、荧光检测的高效液相色谱法对蔬菜、水果中的氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物进行多残留快速测定。蔬菜、水果样品经一次处理，在1.0～1.5h内可完成农药残留的检测，确定有无超标和违禁农药残留。该论文是他们引进国际先进农业科学技术项目的资助课题的部分内容，全文介绍如下：



二、实验部分

2-1 试剂和仪器

试剂——涕灭威(aldicarb)及其代谢物涕灭威砜(aldicarb sulfone)和涕灭威亚砜(aldicarb sulfoxide)、克百威(carbofuran)及其代谢物3-羟基呋喃丹(3-hydroxyl carbofuran)、灭多威、甲萘威、异丙威等8种杀虫剂及其代谢物标准品(ChemService公司)；乙腈、二氯甲烷均为分析纯，经重蒸处理后使用，甲醇为HPLC级，使用前过0.45μm滤膜；二氯甲烷为天泰化学试剂厂产品，乙腈、甲醇为四友化学试剂厂生产；氯化钠(分析纯)，于105℃下干燥8h；柱后衍生用碱液和OPA试剂(ortho-_phthaldehyde reagent)均购自美国Pickering公司；水为超纯水，使用前过0.45μm滤膜。

仪器——氨基 (aminopropy1) 固相萃取柱(500mg，Varian公司)；DS200高速组织捣碎机(江苏江阴科研器械厂)；氮吹仪(N-EVAP-1125G，Organomation Associates，Inc．，美国)；食品加工器(1L，博郎食品加工机，德国)。HP1100 HPLC仪，配有荧光检测器(FLSD)、柱后衍生装置、Cl8柱(4.6mm i.d．×25cm×5μm)、CI8保护柱(4.6rnrn i.d×4.5cm)、手动进样器、化学工作站。



2-2 样品采集

由蔬菜市场购买草莓、黄瓜、梨、苹果、土豆、圆白菜各2Kg，随机各取500g。做添加回收试验时，样品需用水(可适当加入少量碱液)清洗后再处理；做实际样品测定时，样品不经水洗，直接处理。



2-3 样品处理

样品制备：取500g样品在铺有牛皮纸(一个样品换纸一次)的菜板上切成小块后在食品加工器中粗粉碎，备用。

萃取：准确称取25.0g粉碎好的样品置于100mL烧杯中，加50mL乙腈，转移到高速组织捣碎机中，高速匀浆1min.。将匀浆好的样品过滤到100mL具塞量筒 (量筒内放有5～8g NaCl，量筒口放有带滤纸的玻璃漏斗)内，收集滤液后盖上塞子，剧烈振摇1min，静置l0min，使乙腈相与水相分层。准确吸取10mL上层乙腈相溶液，放到l00mL烧杯中，在80℃蒸汽浴上在缓慢氮气流吹动下蒸发至近下，待净化。

净化：用2mL甲醇-二氯甲烷(体积比为1:99)溶解样品，将其加到固相萃取柱 (使用前先用4mL上述甲醇-二氯甲烷平衡该固相萃取柱)中，靠重力过柱。用l5mL离心管收集洗脱液，用2mL甲醇-二氯甲烷(体积比为1:99)洗涤烧杯，并将其注入固相萃取柱（重复二次），收集洗脱液，在氮吹仪上于55℃下蒸发至近干，用甲醇准确定容至2.5mL，过0.2μm滤膜，待HPLC分析。



2-4 液相色谱条件

色谱柱：Cl8柱；流动相为甲醇和水，采用梯度洗脱 (梯度洗脱程序见表1)；柱温：42℃；柱后衍生条件：碱解反应室温度为l00℃，碱液流速为0.3mL／min，OPA试剂反应温度为室温，流速为0.3mL／min；荧光检测器的激发波长为330nm，发射波长为465nm；运行时间30min。

表-1 以甲醇-水为流动相的梯度洗脱程序




3、 结果与讨论

3-1 回收率

对8种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物分别用圆白菜、黄瓜、梨、苹果、土豆、草莓等6种蔬菜、水果按0.10，0.50mg/kg添加水平进行了加标回收试验，得到了很好的回收结果 (圆白菜、苹果和黄瓜的回收率及其相对标准偏差(RSD)见表2。由表2可以看出：在两个添加水平上，8种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物的平均回收率都在70％～120％，RSD在20％以下，符合农药多残留检测的回收率和RSD要求。



3-2 分离性能及最低检出浓度

8种氮基甲酸酯杀虫剂及其代谢物在C18柱上得到了很好分离(见图1)。由图1可以看出：在本实验条件下，8种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物都取得了较好的分离效果和很好的峰形，没有相互干扰，符合农药多残留检测的方法要求。

按S/N=3计算，8种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物的最低检出限分别为涕灭威砜0.0070rng/kg,涕灭威亚砜0.0103mg／kg，灭多威0.0094mg／kg，3-羟基呋哺丹0.0106mg／kg，涕灭威0.0051mg／kg，克百威0.0100mg／kg，甲萘威0.0042mg／kg，异丙威0.0079mg／kg。

荧光检测器只对带有荧光基团的物质产生响应，因此可有效去除样品中杂质的干扰。本方法采用柱后衍生系统使氨基甲酸酯杀虫剂衍生成带有荧光基团的物质，从而大大提高了方法的灵敏度。

表-2 氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物的添加回收率（n=3）




图- 1 8种氨基甲酸酯杀虫剂及其代谢物色谱图

A 8种标样 B 圆白菜 C 苹果 D 黄瓜



参考文献

1. GB/T 17331-1998

2. Corsby D G .J Ass Offic Anal Chem ,1974,57: 788

3. Leitch R E . J Chromatog Sci ,1971,9: 531

4. Lawrence J F ,Frei R W . J Chromatogr , 1974,98 :253

5. NY/T488-2001

农药残留检验方法系列讲座（46）欧盟农残质控程序编译

欧盟农药残留分析的质量控制程序



摘 要：本文概述了欧盟农药残留分析的质量控制程序，包括实验室的认可、样品的采集、运送和处理、农药标准品的一致性、纯度和储存、标准溶液的制备、使用和储存、样品中被分析物的提取、浓缩和定容、分析过程中污染和干扰的控制、对分析方法和分析作业的要求、分析校准的方法和要求;以及结果的确证、计算、分析和报告等。



前 言

欧盟在食品中农药残留的控制领域处于世界领先水平，至2003年已制定食品中的农药最高残留限量（MRL）标准28689项。与此相适应，为了确保农药残留检测结果的准确度和精密度，并使检测工作符合成本-效益原则，欧盟也制定了详细严格的（农药残留分析质量控制程序）。现将该程序的主要内容概述如下：



1 实验室认可

依照欧盟93/99/EEC指令的规定，实验室运转必须符合得到认可的配置要求，并遵循国际标准组织规范（ISO 17025）和良好实验室规范（GLP）。农药残留分析质量控制程序也是实验室认可的指导方针。



2 样品的采集、运送和处理

2.1 样品的采集和运送

采样应符合欧盟79/700/EEC指令及其替代法令，采样方法必须进行记录。采集的样品必须放在清洁、结实的容器或包装内运送到实验室。对大多数样品，可用聚乙烯袋，但对于那些要进行薰蒸剂残留分析的样品，必须采用低渗透性的包装袋（如尼龙薄膜袋等）。已有零售包装的样品在运送前不应该去除原有的包装：非常容易破碎或腐烂的物品（如成熟的树莓），应该将其冷冻后放在“干冰”等冷冻剂中运送，运送过程中谨防解冻；在采集的时候是冷冻的样品，运送过程中也不能解冻；可能由于低温受到损害的样品（如香蕉）在运送过程中必须保持适当的温度。

大多数的新鲜样品必须尽快送到实验室（最好在当天）送到实验室的样品，其外观状况应与内行的消费者可以接受的状态相近，否则，该样品应被视为不适于分析。样品要有清晰牢固的识别标记，防止造成标记的遗失和混乱。但在装有供薰蒸剂残留分析的样品的包装袋上不应该用含有有机溶剂的记号笔做标记。

2.2 分析前样品的预处理和处理

送到实验室的样品应立即进行编号和登记，同一个实验室内，一个编号只能用于一个样品。送到实验室的样品，应在发生可见的变化前进行预处理、处理和二次取样，获得检测样。经过罐装、干燥等加工的样品必须在规定的保质期内进行分析，必要时采用冰冻储存。

样品的处理和储存程序应被证明对样品中的待测残留物没有明显的影响。易发生变化的残留物采用常规的处理方法可能造成损失的，可将样品粉碎后冷冻（如放在干冰中）。如果知道粉碎可能影响残留物（如二硫代氨基甲酸酯类或薰蒸剂），实践中可供选择的程序都不适用时，则检测样应由完整的物品或从大的物品单元取下的一部分组成，全部分析应该在尽可能短的时间内完成。对于非常易变的或不稳定的残留物的测定，应该在收到样品的当天开始并完成分析。

如果单一的检测样不能代表待测样品，可对多个重复的检测样进行分析，以得到一个可靠的平均值指标。



3 农药标准品及校准溶液

3.1 标准的一致性和纯度

被分析物和内标的纯标准品的纯度是非常高的。每一种纯标准品必须要有独特的标识，并记录收到日期，如果供应商没有标示有效期，则应自己确定一个有效期。原定的有效期到后，如果确信其纯度还是可以接受的，则这个纯标准品还可继续保留，并确定一个新的有效期，否则就必须进行更换。新老纯标准品的相对纯度可以通过比较检测器对新制备的稀释液的反应来确定。且必须对显示出的浓度差异或新老纯标准品的一致性进行调研。如对该实验室来说，这是一个新的被分析物，则最好应对新获得的纯标准品的同一性进行查证。

3.2 标准品的储藏

纯的标准品应按照供应商的使用说明进行储藏，以最大限度地防止降解。一般地，在低温（电冰箱或冷藏箱）、黑暗和密封条件下储藏即可达到要求。如果一种纯标准品在储藏过程中发生可见的变化（由于冷冻或熔化引起的变化除外），在没有对纯度进行检测前不应使用。

3.3 母液和工作标准液的制备、使用和储存

被分析物和内标纯标准品的母液和工作标准液制备过程中的各个细节都要十分注意，制备中的任何疏漏也许不会在校准溶液的核查或复查中显现，但将直接影响残留分析结果的准确性。纯标准品的匀质性和质量（或体积），溶剂（或其它稀释剂）的匀质性和体积以及稀释步骤等都必须记录下来。母液和工作标准液的浓度必须根据纯标准品的纯度进行校正，并贴上牢固的标签。

被分析物（和内标）在制备溶液时用的溶剂中必须要有足够的溶解性，但不能产生反应。溶剂也必须与所用分析方法的要求相符，与所用的检测系统兼容。

除非有相称的高精确度的设备可用，纯标准品的称量至少要有5～10。如果被分析物是挥发性液体，可以通过称重或量体积来取得一定量的标准品，并直接加入溶剂中。如果被分析物是气态物（薰蒸剂），可以以气泡的形式通入溶剂中，最称溶剂的增量，也可用气体稀释法制备标准气体（如采用不透气的注射器等）。

制备的被分析物溶液（或其它稀释液）必须确定一个有效期限。新配制的标准母液应稀释后（如果必要）与原先过期的标准液进行比较。如果新标准液测定结果的平均值与老标准液的差异超过±5%（平均值的t检验没有达到5%水平的显著差异），则需再新配一个标准液，通过比较核对其精确性。如果为区分变异性较大的被分析物的标准液是否有±5%差异需要重复测定的次数太多，则可接受的差异范围可增加到±10%。如果老标准液的响应值小于新标准液的95%（变异性较大的被分析物小于90%），则应缩短该标准液的有效储存期或改善储存条件。如果新老标准液的响应值没有显著差异，则可考虑适当延长有效储存期。二硫代氨基甲酸酯类的水悬浮液和高挥发性薰蒸剂溶液（或稀释气体）现用现配，这类标准液的浓度可通过比较独立配剂的溶液来核对。

标准溶液不能曝露在直射的阳光下，应储存在低温和黑暗的条件下，如存放在冰箱或冷藏箱内，并做好密封以避免溶剂的损失或水分渗入。从低温的储存条件下取出的标准溶液，必须让其与室温达到平衡，并摇匀再行使用。如果在低温下其溶解性是有限的，就要特别注意，确信溶液储存后被分析物已经重新完全溶解。

除非标准溶液内有内标，否则溶液内溶剂的蒸发损失是不可接受的。在没有内标的情况下，小体积溶液中的溶剂损失难以监测，这就要求特别注意，以避免蒸发损失。隔膜密封特别容易发生蒸发损失（此外也是一个污染源），刺破后如果仍想保留标准溶液，应立即更换密封隔膜。



4 提取和浓缩

4.1 提取条件和效率

为最大限度地提高提取效率，试样都应进行完全的破碎，除非已知破碎是不必要的（如一些超临界流动性抽出物的提取）或不适当的（如薰蒸剂或表面残留的测定）。如果温度、等因素对提取效率、被分析物稳定性或溶剂损失等有影响，则必须对这些因素加以控制。

4.2 抽出物的浓缩和稀释定容

抽出物蒸发时必须非常小心，避免蒸发干了，使一些微量的被分析物造成损失。为防止出现这种情况，可加入少量高沸点溶剂作为“保护剂”，并把蒸发温度控制得尽可能低。必须避免用发泡、强烈沸腾或喷雾的方法来浓缩抽出物。对于小规模蒸发，采用干的氮气流或真空离心蒸发一般比空气流更为可取，因为空气更可能导致发生氧化或导入水分和其它污染物。

在对抽提物稀释定容时，应采用不少于1容量的经过精确校准的容器，并避免进一步的蒸发。也可以采用一个内标，特别对定容容积比较少时更为适合。

在方法确认过程中应对被分析物在抽提物中的稳定性进行调研。将抽提物储存在冰箱或冷藏箱内会使降解减到最少，自动取样器也不能放在高温的条件下，否则可能使被分析物产生潜在损失。



5 污染和干扰

5.1 污染

在递送和实验室储存期间，不同的样品之间必须相互隔离，并避免与其它潜在的污染物接触。这对于表面残留、粉末状物质的残留或挥发性的被分析物都是特别重要的。知道或料想有这类残留的样品，应用聚乙烯袋或尼龙袋分别进行双层密封后递送，并分别进行处理。

农药残留检验方法系列讲座（46）（中）欧盟农残质控程序编译

实验室及其附近的有害生物防治采用的农药必须仅限于那些不会造成残留的农药。

测量体积的设备（如长颈瓶、吸液管、注射器等）必须进行仔细的清洁，再次使用时尤其必要。为避免交叉污染，对于标准液和样品抽提物应尽可能采用不同的器具。

不要采用有严重擦痕或蚀刻的玻璃器具，对薰蒸剂残留分析所用的溶剂应进行核查，确信其不含有被分析物。

采用内标时，必须防止抽提物、被分析物溶液和内标之间无意识的相互污染。

在有被分析物自然出现或自然产生的样品中（如各种日用品中的无机溴化物、土壤中的硫等），由农药使用产生的低水平残留不能从自然水平中判别出来。在结果的阐述中必须考虑到这些被分析物的自然发生因素。二硫代氨基甲酸酯类、乙烯硫脲或二苯胺能出现在一些类型的橡胶制品中，这些污染源必须注意避免。

5.2 干扰

分析器材、容器、溶剂（包括水）、试剂以及过滤器等应该被作为可能的干扰源进行核查。橡胶和塑料制品（如密封圈、保护手套、洗涤瓶）、上光剂或润滑剂也常常是干扰源。小瓶的密封圈应衬有聚四氟乙烯。抽提物应避免与密封圈接触，特别在封口刺破后更应保持瓶子直立以避免接触。如果这一抽提物有必要再次进行分析，则装抽提物的瓶子封口在刺破后必须尽快替换。采用试剂空白分析可确定所用设备和材料中的干扰源。

干扰常常来自于样品的自然要素。如果干扰是对被分析物响应的复盖，则需要采用不同的提纯度或不同的测定系统。如果干扰表现为检测系统反应的抑制或增强，则可以采用第6.2节中介绍的方法处理。如果这样还不能排除干扰，也不能通过基质匹配校正来进行补偿，则因遵循第7.1、7.4和8节中介绍的标准进行全面的准确度和精密度分析。



6 分析校准

6.1 一般要求

正确的校准依赖于被分析物的正确定性。如果检测系统在绝对反应（外标校验）和相对反应（内标校验）中显示出显著的偏差，则应采用定标试验校准。在一批同一项目的检测中，应将校验标准分散在不同的位置上，以考察不同顺序位上的反应差异。利用反应强度来量化的残留必须在检测器的动态范围内。

对于每一批被分析物，检测系统都要进行校准。如果要求对所有被分析物进行校准意味着有一个非常大量的校准检测，检测系统也可在每一批被分析物中选择有代表性的被分析物进行校准。但在6个月内所有的被分析物至少要轮回校准1次，校准时至少要设2个水平（包括最低校准水平）。

依靠代表性被分析物进行校准必然带来增加错误结果（特别是假阴性）的风险。因此，为了使所有被分析物都能获得可以接受的结果，选择代表性被分析物必须非常仔细。代表性被分析物的选择应依据各种被分析物的理化特性，并服从于以下2点：①在供分析的样品中所有被分析物都可能检测到；②被分析物可能给出最少和最大的变异反应和回收。

当一个代表的被分析物在一个样品中被检测到，结果只能被看作是初步的。该样品应进行再次分析，并同时进行可接受的回收试验和对检测到的被分析物的校准。这对于要做出一个农药残留超标的结论是必需的。

如果一种所代表的被分析物的回收或校正的程序在第一次尝试时产生不可接受的结果，则在那种被分析物上次的成功回收或校准后产生的所有结果必须作为潜在的假阴性来处理。

在最低校准水平（LCL）之下的残留应被看作是没有得到校准，因此，无论检测时是否有明显的响应，都应报告为
在采用3个或3个以上校准水平的情况下，适当的校准函数可以在最低校准水平和最高校准水平之间计算和利用。校准曲线（可以是直线或曲线）不一定非要通过原点。校准函数的拟合必须通过绘图或视觉检查（避免过分依赖于相关系数），确信在残留检测的相应区域内有满意的拟合。如果在检测的相应区域内有个别点偏离校准曲线超过20%（在接近或超过最高残留限量的区域超过10%），则需要做一个更为满意的校准曲线，否则必须进行重复检测。

如果检测器的响应是随着时间变化的，那更频繁的单水平校准比次数较少的多水平校准能获得更正确的结果。在采用单水平校准时，如果超过最高残留限量，则样品的响应应该在校准的标准响应的±10%范围内。如果没有超过最高残留限量，则样品的响应在校准响应的±50%的范围内，除非可接受的响应曲线显示支持进一步的外推。在相当于最低检测水平处进行加标回收检测时，<100%的回收率可以利用在最低检测水平处的单点校准来计算得到。这种特别的计算方法仅仅表示分析性能达到最低校准水平，而并不意味着低于最低校准水平的残留可用这种方法来计算。

含有高水平残留的抽提物可以稀释到校准范围内，而校准溶液必须基质匹配（见第6.2节），因此，基质中的抽提物浓度可能必须进行调整。

检测的批量应作适当调整，以使检测器对包括校准标准在内的响应的漂移不超过20%。如果最低校准水平接近最低检测限，则在小于2倍最低校准水平处的响应的漂移不超过30%。如果接近或超过最高残留限量，则这个最大漂移值应分别为10%和15%。如果在整批的检测过程中最低校准水平的响应保持可接受，样品显然不含有被分析物，则即使漂移超过上述规定值，重复检测也是没有必要的。

但是，正的结果和回收值应该在漂移可接受的条件下通过重复检测来进行量化。

6.2 基质效应和基质匹配校准

发生基质效应的可能性将在方法确认的基础上进行评估，基质效应的发生和强度都有很大的变异性，但有些技术对于控制这些变异性是相当有效的。如果采用的技术不能自然地消除这些效应，也没有一种可供选择的方法可以得到相当的或更为精确的结果，则校准通常将进行基质匹配。可以利用空白基质的抽提物（对于液上气体分析可以是样品）来进行校准，但消除每一个基质效应的最好方法是采用加标校准。

一个潜在的问题是同一种物品的不同样品、不同的抽提物类型、不同的物品和不同的基质浓度可能显示出不同量级的基质效应。如果一个轻微的校准误差是可以接受的，则可以用一个有代表性的基质来校准范围广泛的样品类型。

在气相色谱分析中，如果需要，填充物应该在一批样品检测中的第一系列校准检测前进行校准。

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6.3 农药混合物对校准的影响

利用混合的被分析物溶液等进行校准时，应该用由单一的被分析物获得的检测器的反应是否有相似性进行核对确认。如果反应有显著的不同，或有成倍的差异，则残留必须用基质中单一的校准标准（通过加标的方法更好）进行量化。

6.4 异构体混合物农药等的校准

在校准标准是被分析物不同异构体的混合物时，通常假设检测器对每一个不同成分的反应是相似的。然而，如果标准中的构成比率显著地不同于要检测的残留，则酶分析、免疫分析和以生物学为基础的其它分析可能产生校准错误，此时应该采用一个可供选择的检测系统来量化残留。在一个比较传统的检测器对异构体的反应不同（如六六六异构体在电子捕获器中不同的电子捕获效率，阿维菌素不同异构体在电子雾电离中的不同质子吸引力）的情况下，必须采用单一的校准标准。如果为此目的没有可用的单独标准，一个可供选择的检测系统应该被用于残留的定量分析。

6.5 利用衍生物或降解产物进行校准

在残留分析是检测农药的一种降解产物或衍生物时，如果可能的话，校准溶液应该由降解产物或衍生物的纯标准来制备。



7 分析方法和分析作业

7.1 分析方法的可接受性

分析方法应通过实验来确认，对该方法检出的所有混合物成分，在适当的水平下其平均回收率应在70%～110%的范围内。如果没有达到这一要求，也没有满意的可供选择的其它方法，则在采用该方法前应考虑其较差的精确性。

7.2 脂肪或干重含量的测定方法

当结果以干重或脂肪含量为基础表示时，所采用的测定干重或脂肪含量的方法必须是一致的，最好是一个被广泛认可的方法。

7.3 常规的回收测定

如果可能的话，最好在每一批检测时都对所有的被分析物进行回收试验，如果这一要求意味着要进行非常大量的回收试验，那么，也可在每一批被分析物中选择有代表性的被分析物进行回收试验。但在6个月内所有的被分析物至少要轮回进行1次回收试验，回收试验至少要设2个水平（包括最低校准水平）。倘若有一种基准材料含有相应的被分析物，且含量适当，则基准材料分析是可以接受的。

被分析物的回收试验应该经常进行，加标的量应在相当于最低校准水平1～10倍的范围内，或在最高残留限量水平。加标的水平可以间歇地或有规律地变化，以提供在一定浓度范围内的分析性能的信息。在相当于最低校准水平和最高残留限量水平的回收试验是特别重要的。如果空白材料难以获得（例如检测低水平的无机溴化物）或可以获得的空白材料中含有一种低水平的可以接受的干扰物，回收试验的峰值形成水平应大于等于空白材料中的水平的5倍。

7.4 分析作业的可接受性

常规的回收试验结果在60%～140%范围内是可以接受的，如果低于60%，则这一批样品通常应该进行重新分析。

例外的情况是，当回收率比较低，但精密度比较好，且这个农药使用的背景可以很好地确定（例如根据农药在这一地区的分销情况），则平均回收率稍低于60%也是可以接受的，但应尽可能采用一个更加精确的方法。

当常规的回收试验结果高于140%，且没有残留物被检出，则没有必要重新分析样品以证明不存在残留物，但对于一贯的高回收率应进行调查。如果回收率稍微超过60%～140%的范围，则受影响的该批样品的分析结果可以被看作是半定量的。

要确认农药残留超标的分析结果，要求其回收率在70%～110%范围。如果回收率不能达到这一要求，则必须做出相应的说明。

7.5 熟练程度测验和基准材料分析

回收试验不能证明全部的精确度或结果偏差，所以，必须对实验室进行相应的熟练程度测验。可以有规律地进行内部的基准材料分析，如果可能的话，也可以在不同的实验室之间交换这些基准材料，以提供一种外部客观的精确度校对。

8 结果的确证

如果一批检测的回收率和最低校准水平是可以接受的，则阴性的结果可以直接确证。如果只有代表性被分析

物的回收率和最低校准水平的资料，则阴性的结果也必须谨慎地加以说明。

对于阳性的结果，除了上面对阴性结果的要求外，还要求有进一步的确证并逐例审查。残留超标的结果必须用可疑性最小的技术（或几项技术的结合）来鉴别，并至少进行一次重复检测来进行查证。

当与被分析物没有关联的离子在一个峰形平均的“全扫描”光谱中不超过电子碰撞电离光谱中的基峰强度的1/4或所有其它电离方法的1/10时，则这个光谱的鉴别证据可以被看作是充分的。在没有关联的离子超过这个限度，且它们起源于色谱上重叠的种类时，则应该再找到其它的确证证据。

在许多情况下，采用带有光谱捕获的电子碰撞电离）质谱系统或二级质谱系统可以为定性和量化提供很好的证据。如果离子的同位素率或被分析物异构体的色谱图是高度典型的，则确证的证据也是充分的。另外，通过下列方法也可找到一些确证的证据：（1）一个不同的色谱分离系统；（2）一种不同的电离技术；（3）二级质谱；（4）中-高分辨率的质谱；（5）通过改变液质联用仪的“圆锥电压”来改变破碎作用。

如果可能的话，可由一个独立的实验室或采用不同的检测技术来进行结果的确证。
9 结果报告

9.1 结果的表达

通常在结果报告中残留量的单位以mg/Kg表示，并说明是否超过最高残留限量，在最低校准水平以下的残留应报告为<（LCL） mg/Kg。

9.2 结果的计算

对残留分析结果的数据一般不根据回收试验的结果进行调整。

如果确证的残留数据源自一个单一的检测样，报告的结果应该是源自被认为是最精确的检测技术。如果一个单一检测样的结果由2个或2个以上同等精确度的技术获得，可以报告其平均值。如果对2个或2个以上的检测样进行了分析，则应报告从每一个检测样获得的最精确的结果的算术平均值。如果样品进行了充分的粉碎和（或）混合，对于明显高于最低检测限的残留，不同试样的结果之间的相对标准误差不应超过30%。

如果一种农药的残留是由2种或2种以上被分析物分别检测结果的综合，则需要根据检测的目的来选择适当的报告限度。表1中以硫丹为例列出了报告限的3个选项。




9.3 数据的舍取

<0.1mg/Kg的结果应保留1位有效数字，0.1～10mg/Kg的结果应保留2位有效数字，≥10mg/Kg的结果应保留3位有效数字，或取整数。报告限在<10mg/Kg时应保留1位有效数字， ≥10mg/Kg时应保留2位有效数字。这些要求并不表示多余的有效数字不可靠，这些数据可以记录下来在统计分析中利用。
9.4 测定结果的不确定性分析

分析数据的不确定度是反映对数据信心的定量指标。不确定度必须考虑所有的误差来源，如果几个实验室分析同一个样品，也包括实验室之间的差异。

典型的不确定度可以利用国际标准化组织的“度量中不确定性的表达指南”或欧洲化学度量国际可追溯性网络/分析化学国际可追溯性合作组织（EURACHEM/CITAC）的“分析度量中不确定性的量化”（第2版）中介绍的方法进行评估。所用的数值可以源自内部确认的数据、对基准材料的分析、合作方式得到的资料以及评估资料等。反映可再现性的相对标准偏差（RSD）可被用作不确定性的依据，但其它不确定性根源（如实验室样品的异质性、抽提功效以及标准浓度的偏差等）也应尽可能地加以考虑。

对于一个特殊的样品，用于不确定度分析的资料可以来自5～10次重复检测的结果和同时进行的相应的回收试验资料。这仅仅在结果是非常重要的及有疑问的时候才采用。

由于采用了基于最低校准水平的检测限，故不需要考虑小于最低校准水平的结果的不确定度。

9.5 结果的阐述

在农药残留水平接近于最高残留限量时，通常主要的问题是评价该样品的残留是否超标。作结论时应该考虑分析质量控制资料、重复进行的分析检测结果和典型的不确定度的评价。同时，还必须考虑到在采样前后及采样过程中发生的残留损失或交叉污染。

9.6 资料的保存

样品资料记录、实验室记录、色谱图、检测结果、储存有色谱或光谱资料的磁盘等等必须妥善保存以供详细审查。保存的时间应按照国家或委托方的要求确定。



摘自《中国卫生检验杂志》2005年2月第15卷第2期

由胡文兰，张志恒两位编译

农药残留检验方法系列讲座（47）水稻土中有机氯农药残留测定方法比较

水稻土中有机氯农药残留测定方法比较



摘 要 研究国标方法对土壤中有机氯农药六六六、DDT残留的测定结果，并与美国国家环境保护总局USEPA 8080方法进行比较。结果表明，在本方法的研究条件下USEPA 8080方法对土壤中有机氯农药残留的测定结果显著高于国标方法，但用USEPA 8080方法测定结果仅比国标方法测定结果高14％，可以认为两种方法都适用于一般性的研究。



前 言

分析土壤等样品中的有机氯农药六六六、滴滴涕（DDT）残留，常用的分析方法有我国的国标方法（CB/T 14550－93）和美国国家环境保护总局制定的USEPA8080方法[1,2]。USEPA 8080方法是萃取土壤样品中有机氯农药的经典方法，此方法提取时间长，溶剂耗费最大）对实验人员健康危害也较大[3,4]。本文以苏南某市农田土壤为代表，研究了GB／T 14550-93方法对土壤中有机氯农药的提取效果，并与USEPA8080方法进行了比较。



这是国家重点基础研究发展规划项目；中国科学院创新方向性项目；江苏省农产品清洁创新研究与实施和江苏省环保发展项目共同资助的研究的部分内容，由王 霞1，2、董元华l 、安 琼1 、王 辉1（l中国科学院南京土壤研究所 ；2江苏省环境监测中心）共同完成，现全文介绍如下：



1 实验部分

1．1 供试土壤的采集与保存

在本实验室相关研究的基础上，选取苏南某市曾被有机氯农药污染的水稻田为调查区域。按梅花式布点法多点（6～l0点）采集耕层（0～20cm）土壤，混匀，装入布质土样袋中，然后置冰箱冷藏室中密封低温保存。一部分土样风干，磨碎，过60目筛，待测有机氯农药残留量：另一部分土壤仍以鲜样保存，待测有机氯农药残留量。

1．2 试剂和仪器

标准化合物：含待测有机氯农药六六六和DDT（α－HCH、 β－HCH、γ－HCH、 δ－HCH、p,p＇－DDE、O,P＇－DDT、p,p＇－DDD、p,p＇－DDT）的标准液购于中国标准研究所，各组分浓度均为100μg／ml（正己烷）：以石油醚逐步稀释至各组分浓度范围为1.0～200 ng／mL用于制作工作曲线。含16个组分的有机氯农药（α-HCH、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、p,p＇-DDE、O,p＇-DDT、p,p＇-DDD、p,p＇-DDT、），购于Supelco公司，以石油醚配制成各种农药浓度均为2000 μg／L的混合标准储备液，取此混合标准储备液以正巳烷逐步稀释，配制成校正曲线工作液。

浓硫酸、丙酮、石油醚（重蒸馏）均为分析纯。无水硫酸钠为分析纯试剂，650℃灼烧4h纯化，储于密闭容器中。硅藻士为试剂级，硅胶（100～200目）为色谱层析用试剂，于105℃活化24h待用。氟罗里硅土，60～80目，650℃灼烧6 h，冷却后储于密闭容器内备用，使用前于130℃活化4 h。

实验仪器包括：水浴锅、脂肪提取器、蒸发浓缩器（K－D）、旋转浓缩蒸发仪。

1．3 样品的提取与净化

1．3．1 国家标准有机氯农药测定方法（GBrr14550－93）

称取20 g土壤样品（风干，过60目筛），无损地移入滤纸筒内，放人索氏提取器中。加100 ml石油醚-丙酮（1:1）浸泡12 h。水浴加热（63～64℃）回流提取6 h，将提取烧瓶中的土壤提取液转移至250 ml分液漏斗中，用10 ml石油醚分3次洗涤提取烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中。向分液漏斗中加入100 ml硫酸钠溶液（浓度为60 g／L），振摇1min，静置分层后，弃去水相。留下的石油醚提取液待净化。向分液漏斗中加入5 ml浓硫酸，慢慢振摇。静止分层后，弃去硫酸层。此过程反复进行数次，直至浓硫酸层呈现无色为止。再向分液漏斗中的石油醚层加入其体积量一半左右的硫酸钠溶液，振摇2 min。放置分层后，弃去水相。如此重复（3次以上）到提取液里中性（水相pH≥5）时止。石油醚提取液再经无水Na2SO4柱脱水后，滤入适当规格的K－D浓缩瓶中，K－D浓缩，定容至l0 ml，混匀，为待测液。待测液置入冰箱中密封避光低温保存，1周内完成气相色谱测定。

1．3．2 美国环境保护局有机氯农药测定方法（USEPA 8080）

将10 g土壤样品和10 g无水硫酸钠混合，转入滤纸筒中，将滤纸筒装入索氏提取器中，在500 ml圆底烧瓶中加入300 ml石油醚－丙酮（l:1）提取剂，在50～65℃恒温水浴上加热提取24 h，冷却后，将提取液移入500 ml的分流漏斗中，用l0 ml石油醚分3次冲洗提取器，洗液并入烧瓶中。用旋转蒸发浓缩仪将样品浓缩至l0 ml。向玻璃层析柱（2 cm×25 cm）中加60 ml石油醚，依次加入l cm 高的无水硫酸钠，20g氟罗里硅土和I cm高无水硫酸钠，以5 ml／min的流速预洗脱柱子，弃掉淋出液。将500 ml K-D浓缩瓶置于层析柱下，打开层析柱活塞，将浓缩的样液转移入柱内，用2 ml石油谜冲洗浓缩瓶2～3次，一并移入层析柱，最后加200 ml含60 ml/L乙醚的石油醚溶液（V／V）以大约5 mL／min的流速洗脱柱子，收集全部洗脱液。用旋转蒸发浓缩仪，于40℃水浴浓缩洗脱物，最后调整体积至l0 ml，供气相色谱测定。

1．4 色谱分析

气相色谱仪：Agilent HP－6890气相色谱仪，配微池电子捕获检测器（μ－ECD），以及7683自动进样系统和色谱工作站；色谱柱为DB－1701型石英毛管色谱柱（30 m×0.32 mm ×0.25 μm）。

工作条件：载气为He，流速2 ml／min，辅助气为高纯N2，流速60 ml／min；进样量：1μl，不分流进样，柱前压为8.l0 psi。进样口温度210℃，检测器温 320℃，柱温165℃，保持2 min，以6℃／min的速度升温至265℃，保持2 min。以峰高外标法定量。



2 结果与讨论

2．1 两种方法的概述

GB/T 14550－93方法和USEPA 8080方法在土壤样品的提取、净化方面均有较大差异。主要体现为两者所需样品量、提取剂用量及提取时间不同：净化样品所选用的手段不同：国标方法是利用磺化手段净化样品，而USEPA方法是利用吸附柱层析法（氟罗里硅土）净化样品。而且USEPA方法是对新鲜的土壤样品进行分析，而国标方法选取的分析对象则是风干土壤。

使用GB/T 14550－93方法时，浓硫酸的磺化会使狄氏剂、异狄氏剂等酸不稳定的农药分解，环氧七氯也会部分进入磺化层造成回收率偏低，所以该方法通常仅被用来测定六六六和DDT。而只要选择合适极性的混合液作为洗脱液的USEPA 8080方法可以同时对包括六六六、DDT在内的16种有机氯农药进行测定，因此被公认为是提取土壤中有机氯农药的经典方法；但此方法却要耗费更多的有机溶剂，可能对环境造成二次污染，实验耗时较长，而且所用氟罗里硅土较贵。

从另一角度讲，六六六和DDT是我国农业环境中的主要有机氯污染物 [5]，一般的调查研究选用GB/T 14550－93即可达到目的。如果需要研究七氯等有机氯农药则需要选择USEPA 8080方法。鉴于上述情况，本研究仅就两种方法对六六六和DDT的测定情况进行了比较。8种有机氯农药的色谱峰见图1。

农药残留检验方法系列讲座（47）（下）水稻土中有机氯农药残留测定方法比较

2．2 两种方法对土壤测定结果的差异

对于土壤中有机氯农药残留量常用的分析方法有我国的GB／T 14550－93方法和美国国家环境保护总局制定的USEPA 8080方法。随着目前国内外科技交往日益密切，为了使国内外的研究数据具有可比性，有必要将国标法同国际标准方法进行比对。在相关研究的基础上，本研究选取了有机氯农药污染程度不同的3个样点，分别用GB方法和USEPA方法对样品进行分析。经统计检验，虽然USEPA方法的测定结果比GB方法高，差异达极显著水平（表1），但两者的相对偏差为14％，在规定的平行误差容许范围内。说明在一定浓度范围内，测定六六六和DDT时两种方法都可以使用。另外，为了简化实验，本研究在使用国标方法时，并未在土壤中添加硅藻土，这可能是使用国标方法对土壤测定结果偏低的原因之一。


2．3 对同一样点风干土壤和新鲜土壤测定结果的差异

用USEPA方法和GB方法测定每个样点的风干土样和新鲜土样，结果表明，两种方法对新鲜土样中有机氯农药残留的提取量高于对风干土样中有机氯农药残留的提取量，但统计检验表明，USEPA方法（表2）和GB方法（表3）对新鲜土样和风干土样的测定结果没有显著差异。说明测定土壤有机氯农药残留时，用风干土样或新鲜土样都是可行的。



3 结束语

本研究条件下，USEPA方法的测定结果显著高于国标方法，但两者的偏差在平行样误差容许范围之内。同种方法对新鲜土样的测定比风干土样高，差异不显著。故两种方法均适用于一般性研究，可以根据不同的研究目的，选择其中之一作为研究土壤有机氯农药残留的方法。

此外，本研究调查区域受有机氯污染程度较轻，所以无法判断在污染程度较重的地区，采用GB/T 14550-93和USEPA 8080方法进行室内化学分析，得到的结果之间差异是否较大，这是一个值得深入研究下去的课题。



参考文献

1 国家进出口商检局编．农药残留量气相色谱法．北京：中国对外经济贸易出版社，1986，427

2 美国环境保护局编（中国环境监测总站译）．固体废弃物试验分析评价手册．北京：中国环境科学出版社，1992，208

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4 Arments Automated soxhlet extraction．LC-GC，1999，7（6）：38～42

5 杨惠兰．化学农药的施用与环境保护，河北农业大学学报、1994，17（增刊）∶187～189

农药残留检验方法系列讲座（48） 加速溶剂萃取仪提取食品中有机磷农药残留


利用加速溶剂萃取仪测定食品中有机磷农药残留方法探讨



摘 要： 本文讨论了应用ASE-300 加速溶剂萃取仪提取食品中有机磷农药残留量的方法。经实验，应用加速溶剂萃取仪提取粮食、茶叶、蔬菜、水果等样品，利用气相色谱分析技术，检测了其中敌百虫、甲胺磷、敌敌畏、甲拌磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷等八个组分的有机磷农药残留。提取效率在75-111%之间，精确度、准确度均达到了满意效果。本法快速、简便，样品提取效率高，使用有机溶剂少，降低了检验人员的劳动强度，减少了有机试剂对环境和工作人员的污染，



本文由北京市东城区疾病预防控制中心李冬梅同志撰写，使用加速溶剂萃取仪对多种食物进行前处理，有一定的参考作用，现全文介绍如下。



前 言

粮食、茶叶、蔬菜、水果是人类膳食中不可缺少的食品，近年来食品污染问题日趋严重，其中最严重的当属农药污染。由于有机氯农药在我国已被明令禁止，有机磷农药在我国被广泛使用，其使用量占我国农药总量的70%以上。为防止病虫害的发生，保证高额的产值，农民在农作物的生长期乃至收获、采摘之前，都在大量的使用有机磷农药，至使食品在上市后仍存在一定量的农药残留，给消费者带来伤害。因此，建立高效快捷检测食品中有机磷农药残留的方法迫在眉睫。

当今分析领域，随着气相色谱等分析仪器在基层化验室的普及，分析方法的精密度大幅提高，但复杂样品的前处理，往往滞后于分析方法的发展。有些样品在预处理中存在提取不完全、损失很大的弊端，成为现代分析的薄弱环节。目前测定有机磷农药残留量样品的前处理多为直接有机溶剂浸提，方法操作复杂、费时，提取不完全，并使用大量有毒有害有机试剂，有碍人体健康，并造成环境污染。在以往的数年中，人们做了多种尝试以期找到一种高效、快捷的方法以取代传统萃取方法，如自动索氏萃取、超声萃取和超临界萃取等，虽然以上各法较经典的萃取法相比已有了很大的进步，但仍然存在着有机溶剂用量偏多，萃取时间较长，萃取效率还不够高的缺点。全新的加速溶剂萃取的方法（Accelerated Solvent Extraction 简称ASE）,是一种在提高温度和压力的条件下，用有机溶剂萃取的自动化方法。与前几种提取方法相比，其突出的优点是有机溶剂用量少、快速、损失少、萃取完全。本文应用这一新兴的样品前处理技术-加速溶剂萃取，以气相色谱法定性、定量测定食品中有机磷农药残留，快速简便、成本低廉，大大地减少了有机试剂的使用，更加环保，也保护了实验人员的身体健康。



实 验

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂：

美国DIONEX 公司ASE-300 加速溶剂萃取仪日本岛津GC-17A 型气相色谱仪，配有火焰光度检测器（FPD）CLASS-GC10 气相色谱工作站、KD 浓缩仪、

有机磷农药标准：由国家标准物质研究中心购买 二氯甲烷 、丙酮、硅胶小柱



1.2.实验方法：

1.2.1 样品处理：

萃取：称取一定量的粉碎的样品装入不锈钢萃取池中，拧紧池盖，防入圆盘式传送装置，该装置自动将萃取池送入加热炉腔。萃取池在炉腔内在一定的压力下自动密封，萃取池中开始注入溶剂，加热加压，达到设定温度后，萃取池在炉腔中按用户设定的时间恒定温度和压力，萃取之后分析物及溶剂自动经过过滤进入收集瓶，萃取池中被注入新鲜的溶剂并用氮气 吹扫，完成后萃取池返回圆盘传送装置，下一个样品开始被萃取。

净化：样品收集瓶加入一定量的活性炭脱色，过滤，经过硅胶小柱后，用KD浓缩仪浓缩，用二氯甲烷定溶至1mL，供气相色谱仪分析。

1.2.2.萃取条件：

温度：100℃ 压力：1500psi 时间：5min

溶剂：A 二氯甲烷50% B 丙酮 50%

1.2.3 色谱分析：色谱条件：

色谱柱：DIKMA DM-1 毛细柱 0.25mm×30m×0.25μm

柱 温： 起始温度120℃保持3min，以38℃/min 升至130℃保持5.6min，以38℃/min 升至200℃保持15min

检测器温度：280℃

进样口温度：280℃

进样方式：分流进样，分流比：1：10

柱流量：1mL/min

载 气：N2 纯度 >99.99%

进样量：1.0μL

采用火焰光度检测器（FPD），以保留时间定性，峰高定量。




2 结果与讨论：

2.1 溶剂的选择：

国际上经常用乙腈做有机磷农药残留的提取溶剂，但由于其毒性大，价格昂贵，我们考虑用二氯甲烷和丙酮的混合液，达到了满意的提取率；



2.2 萃取条件的选择：

2.2.1 提高温度使溶剂溶解待测物的容量增加，降低溶剂的粘度，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，增加了溶剂进入样品基体的扩散，从而大大地降低了溶剂的使用量。经试验，我们发现在温度：100℃ 可达到较高的提取效率；

2.2.2 液体的沸点一般随压力的升高而提高。本法增加压力，提高了溶剂的沸点，使溶剂在较高的温度下仍保持液态，加大了对溶质的溶解能力。同时，在加压状态下，可将溶剂迅速加到萃取池和收集瓶中，提高工作效率。经试验，我们确定萃取压力：1500psi；



2.3 提取净化：

由于食品样品种类繁多，基质复杂，我们针对不同的样品采用不同的提取净化方法：

2.3.1 粮食：样品经粉碎后，由于样品颗粒较小，萃取池要加双层滤膜提取样品，提取液用无水硫酸钠脱水，活性炭脱色，经硅胶柱净化；

2.3.2 茶叶：此类干性样品经粉碎后混均取样。提取液用活性炭脱色，经硅胶柱净化；

2.3.3 蔬菜、水果：由于此类样品水分比较大，取样时，要将打碎的样品与硅藻土充分研磨、混均，提取液用无水硫酸钠脱水，活性炭脱色，经硅胶柱净化。硅藻土的加入量视样品的水分大小而定，要将样品中的水分充分吸收，样品沾在倒扣的乳钵上刚好不落下为宜。



2.4 提取效率实验：

取不同的样品混均后加入已知浓度的标准溶液，提取、净化后用气相色谱分析。提取效率在75-111%。(n=33)



3 结论：

本文采用当今世界流行的加速溶剂萃取的样品前处理技术提取并检测样品中有机磷农药共计99 件，其中粮食32 件，茶叶8 件，蔬菜35 件，水果24 件。建立了以二氯甲烷、丙酮做溶剂，提取食品样品的条件，总结了不同样品的提取、净化方法，用气相色谱仪分析。实验表明：用本法提取粮食、茶叶、蔬菜、水果等样品中敌百虫、甲胺磷、敌敌畏、甲拌磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷等八个组分的有机磷农药残留量，提取效率在75-111%之间，具有良好的精确度与准确度。本法快速、简便，样品提取完全，使用有机溶剂少，简化净化步骤， 大大地降低了检验人员的劳动强度，减少了有机试剂对环境和人员的污染，是一种值得推广的萃取方法。

农药残留检验方法系列讲座（49）饲料中三聚氰胺检测方法

饲料中三聚氰胺检测及其危害

摘 要： 三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工原料，其含氮量达66％左右，一些不法企业在饲料中大量添加，造成饲料中粗蛋白质虚高的假相，不仅对养殖业产生不利影响，对人类健康也存在着严重威胁。本文就三聚氰胺的性质、检测及在饲料中添加的危害作简要阐述，供大家参考。

本文由宁夏兽药饲料监察所的谢荣国、武晓宏、杨俊华研究人员根据最近形势的需要在《质量与安全》杂志上发表的文章，现全文介绍如

1 何谓三聚氰胺

1．1 三聚氰胺的定义
三聚氰胺(Melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料，是重要的尿素后加工产品。三聚氰胺简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺。

1．2 三聚氰胺的性质
(1)物理性质：
分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126．12，呈白色结晶粉末，无毒，无味。相对密度1 570kg／m3，堆积密度700～90kg／m3 。在常压下，300℃升华，354℃分解，比热1．473kJ／kg·℃。能溶解于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳。
（2)化学性质：
三聚氰胺显弱碱性，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成盐。在中性或微碱性环境下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性(pH值5．5～6．5)环境下，可以与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。
1．3 三聚氰胺的用途
三聚氰胺是一种用途广泛的有机化工中间产物，最主要的用途是作为生产三聚氰胺／甲醛树脂(MF)的原料。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀、有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。
2 三聚氰胺检测
目前，三聚氰胺检测方法有试剂盒检测法(ELISA)、液相检测法和气质检测法。
2．1 试剂盒检测法(ELISA)
方法原理：
利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。
(1)样品处理
称取1.0g均质过的饲料样品于离心管中，加入10mL甲醇充分混合：15 000r／min离心10min：取上清液lmL于小试管中用氮气吹于；加入2．5mL 10％ 甲醇／20mMPBS溶液充分溶解：移取100μL进行分析。

(2)ELISA检测步骤
将所有试剂及样品提取液回升温度至室温(20～28℃)；用前按试剂盒的要求稀释所用试剂，取相应数量的微孔条，插入框架：吸取100μL标样或样品提取液到相应的微孔：每孔加入50μL三聚氰胺HRP酶标记物：轻轻混合60s，孵育30min(20～28℃)；孵育完后，将微空中的溶液倒入水槽中，用250μL洗液洗板5次：在吸水纸上拍打，尽可能将水拍于；每孔加入100μL底物溶液．孵育30min(20～28℃)；每孔加入100μL终止液；用酶标仪读取在450nm下的吸光值。
(3)作图
以所获得的标准和样品吸光值的平均值除以0标准的吸光值再乘以100为纵坐标．以三聚氰胺浓度半对数为横坐标作标准曲线。确定被测样品的浓度。
2．2 液相检测法和气相色谱一质谱检测法
⑴方法原理：

① 试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化．洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定；
② 净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，O一双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，以气相色谱一质谱联用仪进行定性和定量测定。
⑵ 样品处理
①称取5．00g试样．准确加入50mL三氯乙酸溶液(10g／L)，加入2mL乙酸铅溶液(22g／L)，摇匀。超声提取20min，静置2min，取上层提取液约30mL转入离心管。在12 000r／min离心5min。分别用3mL甲醇、3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱．准确移取10mL离心液分次上柱。控制过柱速度在lmL／min以内． 再用3mL水和3mL甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱．抽干后用5％ 氨化甲醇3mL洗脱，洗脱液在50~C下氮气吹干。准确加入2mL甲醇溶液，涡漩振荡1min，过0．45μm膜．用高效液相色谱仪测定三聚氰胺含量。
② 衍生化
根据液相的定量结果将洗脱液稀释成浓度约为0．5μg／mL。分别吸取稀释液0．5mL用氮气吹干，加入250μL吡啶和250μL衍生试剂，加盖，混匀，70℃反应30min， 同时吸取0．5μg／mL的标准溶液0．5mL做同步衍生，用气相色谱一质谱联用仪确证。
⑶ 仪器条件
① 液相色谱条件
紫外检测器，波长240nm；色谱柱：ZORBAXEclipse XDB—CR，柱长150mm，内径4．6mm，粒度5μm；流动相A：B=93：7 (A：称取庚烷磺酸钠2．02g和柠檬酸2．10g溶解，定容至1L；B：乙腈)，流动相流速1．0mL／min；进样量10μL。
② 气相色谱一质谱联用仪条件
色谱柱：VF-5ms 30m ×0．25mm ×0．25 μm；进样口温度：250℃；进样量：1μL；柱温：起始温度75℃ ，保持1min，以30℃／min升温至300℃，保持2min；载气：氦气；流速：1．3mL/min；传输线温度：280℃；溶剂延迟：5．5min；EM电压：高于调谐电压200V；离子阱温度：220℃：选择离子监测：(M/Z) 99，171，327，342。