薄层色谱法应用系列讲座（29）-加压薄层色谱的原理和应用

加压薄层色谱法的原理及其应用



摘 要：对加压薄层色谱的原理和应用作以介绍。介绍了加压薄层色谱的仪器结构、工作方式；对影响加压薄层色谱的因素、常见问题及解决方法进行了总结；简要地介绍了该方法在分析中的应用情况。



本文由中国药品生物制品检定所的何 轶、鲁 静、林瑞超三位研究人员共同完成，对加压薄层色谱法的原理和应用有详细介绍，值得参考，现全文介绍如下



前 言

薄层色谱法作为一种快速简便的色谱技术已在中草药分析、毒物分析等众多领域中广泛应用。在传统薄层色谱法中，展开剂依靠毛细作用通过薄层吸附剂来完成对组分的分离，因此其分离时间不可控，而且随着展开距离的增加，溶剂前沿的移动逐渐减慢，被分离组分的扩散也越来越严重。针对此情况，分析学家对薄层系统进行了改进，发展了薄层色谱的一个重要分支——强迫流动薄层色谱（forced¨flow planar chromatography，FFPC）。 FFPC是通过外力强迫展开剂在吸附剂中运动，它主要有离心薄层色谱法（rotation planar chromatography，RPC）与加压薄层色谱法（overpressured－layerchromatography，0PLC）两种。RPC通过高速旋转产生的离心力加速展开剂的运动；OPLC则依靠加压泵将展开剂直接泵入薄层板中，并通过泵来调节展开剂的流速[1，2]。

20世纪60年代出现了薄层色谱超微展开室。这种展开室在展开过程中用一块玻璃或塑料膜覆盖在薄层板的表面，从而减少了薄层分离中气相的影响。1979年Tyihak在超微展开室的基础上，在覆盖薄层板的塑料膜上加以一定的压力，并将展开剂压入薄层板，从而发展了OPLC技术；在此之后，该方法在理论、分析条件及应用等方面的研究得到了不断的深人，商品化的OPLC仪及其专用的薄层板也不断推出［1］。本文以市售的OPLC仪为例，对OPLC进行介绍。



实 验

1 仪器结构

薄层板夹（cassette）是0PLC技术的关键部分。板夹主要由两层构成，上层为聚四氟乙烯薄膜层，下层为一块钢板，薄层板吸附剂面向上置于聚四氟乙烯薄膜与钢板之间。在聚四氟乙烯薄膜两边均有一个小孔，溶剂通过这两个小孔进出薄层板。在孔的两侧与薄层板接触的一面刻有凹槽，使溶剂可以快速到达薄层板边缘，从而保证薄层板中间和边缘几乎同时开始展开。在薄层板的边缘有一圈约2mm宽的吸附剂被刮掉，再用高分子材料加上一层密封条，以防止加压展开时展开剂从薄层板边缘溢出。板夹下层的钢板主要起支撑作用。薄层板夹的工作原理示意图见图1。




工作时用一个泵在板夹上加压，最大压力可达5 MPa（50 bar），同时用另一个泵将展开剂输人到薄层板中，以完成分离过程门。OPLC中常用的薄层板有5 cm×20 cm、10 cm×⒛cm以及⒛cm×⒛cm等规格，不同大小的薄层板使用不同的板夹。

OPLC仪主要由两部分构成，其结构如图2所示。仪器上层主要有电源、控制系统以及泵系统等；下层为展开室，工作时将板夹插入。仪器具有独立的加压泵和输液泵系统，可进行分析和制备等工作，并可通过阀切换实现简单的梯度洗脱。此外还有主要针对半制各工作设计的OPLC仪，它仅有一个加压泵和一个展开室，展开剂的输送可通过连接HPLC泵来实现，因此构成一台OPLC仪的成本也较低。


2 工作方式

OPLC属于薄层色谱的一个分支，但由于它采用了泵输送溶剂，因此可进行类似于高效液相色谱的在线分析，也因此有多种工作方式可供选择［3］。

2．1 离线点样—分离－离线扫描

这种工作方式类似于传统的薄层色谱。首先将样品点于薄层色谱板上，然后进行分离，分离后取出薄层板进行定性定量分析。在这种方法中可以同时进行多个样品的分析，此外也可选择多种显色剂进行显色，以提高分析的专属性和灵敏度。

2．2 离线点样－分离—在线检测

在OPLC仪后可以串联高效液相色谱用的紫外或其他类型的检测器，从而进行在线检测。可将样品点于薄层色谱板上用展开剂将其连续洗脱后用检测器测定洗脱液。

2．3 在线进样—分离—离线扫描

在展开室前可以连接高效液相色谱用手动进样器，将薄层板用展开剂充分冲洗润湿后直接在线进样，样品分离后取出薄层板进行检测。这种工作方式每次只能分析一个样品。

2．4 在线进样ˉ分离ˉ在线检测

样品经在线进样分离后也可串联高效液相色谱用检测器进行在线检测。这种方法和高效液相色谱较为相似。因此也有人将OPLC称为平面柱色谱。

针对不同的实验要求可以选择不同的分析方式，这是OPLC一个很突出的优点。

薄层色谱法应用系列讲座（29）（下）-加压薄层色谱的原理和应用

3 加压薄层色谱的分离效果及其影响因素

一般来说，OPLC的分离效果较传统薄层色谱好，原因主要有以下几方面。首先，正如文章开头所提到的，OPLC通过泵将展开剂输送至薄层板，使分析时间缩短，待分离组分的扩散也较小。这一现象在展距增加的情况下更为明显。



从图3中可以看出，随着展开距离的增大，传统薄层色谱中的理论板高迅速增大，但是在OPLC中理论板高变化不大L［，3」。所以在OPLC中可通过增加展距来达到提高分离效果的目的，也因此在OPLC中薄层板的长度多为⒛cm。此外，在传统薄层色谱中，当展开剂到达薄层板的边缘后就不能再进行分离了。但在OPLC中可以用泵连续输送展开剂，展开剂溢出薄层板后分离仍可继续进行，从而提高了比移值较小组分的分离度。这些都对提高分离效果起到了重要作用。

影响OPLC分离的因素主要有以下几方面。首先，OPLC展开室中空间较小，故气相对OPLC分离的影响较少，也有利于提高OPLC的重现性。但是在薄层板的吸附剂颗粒的间隙中仍然存在少量气体，它们会对分离结果产生一定的影响。离线点样与在线进样的分离结果会有一定的差别，就是因为在在线进样前已经充分冲洗润湿了薄层板，去除了其中的气体。此外，吸附在吸附剂表面的气体也会对分离的结果产生影响，在“4．2”节中专门对此进行介绍。

与高效液相色谱相似，OPLC中展开剂的流速也会对分离结果产生影响。流速过大和过小均会导致分离度降低［1］。在分析过程中，输液泵的压力应不大于加压泵的压力，否则展开剂可能从板夹中溢出。在目前市售的OPLC仪中，当输液泵压力达到加压泵压力的80％时，系统报警并自动停止工作。

在板夹上所加压力的大小也会影响到分离效果。文献［1］表明在采用离线工作方式时，所加压力越大，理论板高越小；但是在在线工作方式中，板夹上所加的压力对理论板高影响不大。一般在分析过程中选择使用仪器所能提供的最大压力。早期的0PLC仪提供的最大压力为2，5 MPa（25 bar），现在的OPLC仪最大可提供5 MPa（50 bar）的压力。

此外，温度、所使用的展开剂以及吸附剂的粒度等也会对分离效果有一定的影响，这些影响和传统的薄层色谱相似，不再——讨论。



4 加压薄层色谱中的常见问题及解决方法

4．1 多溶剂前沿（multiˉfront）问题

在传统的薄层色谱中，如果使用多种溶剂的混合溶液作为展开剂，并且展开前没有充分地预饱和，展开剂的不同组分就可能在薄层板上发生分离，从而出现多个溶剂前沿。在离线工作方式的加压薄层色谱中由于减少了气相对色谱的影响，这一现象较传统薄层色谱更加严重。位于第二或其他溶剂前沿的组分通常呈窄条状9如图4－a所示。



如果同时有多个组分位于此处，则很难将其分离开。但是如果在进行制备时，待分离组分位于第二或第三溶剂前沿位置并无其他组分干扰，则只用很小体积的展开剂就可以将该组分洗脱下来。在使用同一个展开剂时，多溶剂前沿出现的位置是固定的，因此可以用同一个样品在距展开起始位置不同的高度多次点样，观察这些样品点在不同位置的峰形变化来判断溶剂前沿的位置［3’4］。可以通过改变溶剂的配比来调节多溶剂前沿的位置。如果仍不能满足要求，则需更换所使用溶剂的种类。



4．2 干扰带（disturbing zone）问题［3，5］

在离线工作方式的OPLC中仍有一部分气体残留。这些气体大部分存在于硅胶颗粒的间隙中，同时还可吸附于硅胶表面。这些气体是出现干扰带的主要原因。在展开过程中，溶剂穿过硅胶颗粒的间隙，将游离的气体推出。同时，吸附剂吸附一部分展开剂分子并释放原来吸附的气体分子。但是，当解吸附的速度比展开剂移动速度低时，被吸附的气体就不能随着游离气体一起被推出而是释放于展开剂中。当展开剂中溶解的气体超过其饱和浓度时，气体分子就会形成微小的气泡c这样在已经饱和的展开剂和未饱和的展开剂之间就可以观察到干扰带。因为含有饱和和未饱和气体的展开剂的折射率不同，因此可以清楚地用肉眼观察到薄层板上的干扰带。从理论上说，干扰带应呈一条直线，但是由于受吸附剂粒度不均匀的影响，在实验中所观察到的干扰带多呈锯齿状，如图4－b所示。

由于干扰带是因被吸附的气体不能被快速地释放所产生，因此可以通过调节展开剂的流动速度（即推动展开剂移动的压力大小）来调节干扰带的位置。一般说来，对于同一种吸附剂和展开剂，在干扰带出现的位置上，流速不同的展开剂所受的压力是相同的，当展开剂的流动速度增大时，推动展开剂移动的压力也增大，被吸附的气体就容易从薄层板上解吸，干扰带向前移动。此外还可以通过改变溶剂种类，增加展开剂对气体的溶解度来避免干扰带的产生。如果以上两个办法均不能去除干扰带的影响，还可在展开前用不推动样品移动的溶剂预洗薄层板。如欲分离极性化合物时用石油醚等非极性溶剂预洗硅胶薄层板，使被吸附的气体充分释放后再进行展开，以减少残存气体的干扰。

以上问题均在离线工作方式的加压薄层色谱中存在，在在线工作方式中，因为已经将薄层板充分润洗，这些问题均不会发生。



5 应用 i

从20世纪60年代出现首台0PLC仪以来，OPLC在植物药分离制备、尿样分析等多领域均得到了广泛的应用。下面举例简要说明其应用情况。

Dallenbach－Toelke等［6］采用普通薄层色谱、高效薄层色谱（IIPTLC）、0PLC和超微室离心薄层色谱（ultra micro－ chamber centrifugal layer chromatography，UCLC）对药用婆婆纳Veronica officinalis中Szikszay等［7］用Automatic Personal OPLCBS－50加压薄层色谱仪（OPLC－NIT Ltd）对phthaloyl－amlodi pine的纯度进行了测定。



在高效薄层板上，以正己烷－醋酸丁酯－醋酸乙酯－氯仿（体积比为60∶15：15：20）为展开剂，薄层板压力5 MPa（50 bar），展开剂体积8 500 pL，所测定的有关物质在0．05～2．00 pg内线性关系良好，测定结果的相对标准偏差（RSD）为2．9％。

Mincsovics等r：］利用OPLC对菊科植物Leuzea提取物中的葫芦巴碱（trigonelline）进行了制各。他们将Leuzea的甲醇提取物点于OPLC硅胶薄层板上，先用展开剂（正丙醇¨甲醇－水（体积比为40：6：60））从出口向人口方向预洗薄层板，然后再从人口到出口方向输送展开剂进行分离。预洗不仅可去除薄层板上的气泡，减少干扰带的产生，同时还可去除样品中部分较易洗脱的植物色素，减少它们对待分离组分的干扰。此外，他们的研究表明，OPLC很适合进行微量制各，一次可对2～5 mg的样品进行分离，得到0，1～0．5 mg的纯品。据介绍，的环烯醚萜苷类化合物进行了分离。展开剂均为醋酸一丁酮－氯仿－水（体积比为25：j／⒌37．5：7．5）。目标化合物在普通薄层色谱中的展距为9 cm；在HPTLC中的展距为4．5 cm；在OPLC和UCLC中的展距均为17 cm（OPLC仪为Chrompres－10（LaborMIM，Budapest，Hungary），薄层板压力为1 MPa（lObar），输液泵压力为0，15 MPa（1．5 bar），先用丁酮对薄层板进行预洗，以去除吸附剂吸附的气体，减少干扰带的影响；UCLC为该实验室自制，采用高效薄层板进行分离）。各种薄层色谱的分离结果见图5，可以看出，普通薄层色谱不能将玉叶金花苷（mus￣saenoside）和米内苷（minecoside）分开，HPTLC仅能将两者刚刚分开。如果在这两种薄层色谱中再增加展开距离，则均导致样品的扩散加剧，因此作者采用FFPC对该样品进行了分离。0PLC和UCLC均可获得较好的分离效果，其中以OPLC效果最好。加压薄层色谱仪还可用专门的板夹使用制备薄层板进行制备，从而使一次制备量达到几十毫克。

薄层色谱法应用系列讲座（30）一种新的展开剂用于薄层色谱分析

摘 要：以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）／正丁醇／正辛烷／水微乳液作为一种新的展开剂，对23种氨基酸进行了薄层色谱分析。研究了微乳液含水量和氨基酸分子结构对Rf

值的影响；同时选择含水量为40%的微乳液对氨基酸混合物进行了分离鉴定并与传统的展开剂作了比较；此外还探讨了微乳色谱理论。研究结果表明，当微乳液为油包水型及油水双连续型时，氨基酸的Rf值多在0.2与0.8之间，色谱分析结果令人满意。



本文由湖北民族学院化工系的田大听、史伯安和谢艳等老师们共同完成的，氨基酸的液相色谱和离子色谱法已经比较成熟，而在薄层色谱法上有自己分析观点的文章不多，可惜没提供TLC分析原图。现全文介绍如下。

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前 言

微乳液是由水、油、表面活性剂及助表面活性剂等在一定配比下自然形成的、无色透明的、低粘度的热力学稳定体系。由于它具有独特的结构与性能，因而备受人们的关注，现已广泛应用于三次采油、化妆品、药剂学、润滑、酶催化、有机合成及无机合成等领域［1~3］。近年来，已经有文献报道将其作为展开剂用于生物碱［4］和氨基酸［5］的薄层色谱（TLC）分析。作者所在课题组曾用十二烷基硫酸钠／正丁醇／正己烷／水微乳体系对氨基酸进行薄层色谱研究［5］，所用表面活性剂是阴离子型。本文选用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）这种阳离子型表面活性剂，并以CTAB／正丁醇／正辛烷／水微乳液作为一种新的展开剂，对氨基酸进行薄层色谱分析，以进一步搞清其中的有关规律，并进一步拓宽微乳液的应用领域。



1 实验部分

1.1 试剂与仪器

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、正丁醇、正辛烷、茚三酮均为分析纯；23种氨基酸均为色谱纯（除DL-β-苯丙氨酸外，其余皆为L型），用二次蒸馏水配成1g／L溶液。硅胶G薄层板，展开池。

1.2 微乳液的配制

本实验所用表面活性剂为CTAB，助表面活性剂为正丁醇，油为正辛烷，水为二次蒸馏水。在保证前三者质量比一定的条件下，改变水的含量，配制成系列微乳液。

1.3 实验方法

用毛细管吸取少量氨基酸溶液于硅胶G板上点样，以上述各微乳液为展开剂，用上行法展开，待展开到一定距离后，取出晾干。用茚三酮显色剂显色，然后计算比移值Rf



2 结果与讨论

2.1 实验结果

微乳液的成分配比及结构见表1。




从CTAB、正丁醇、正辛烷和水体系的拟三元相图［6］可知，在固定CTAB、正丁醇和正辛烷适当质量比的情况下，改变水的含量（质量分数），可得到一个从油包水区（water-in-oil，W／O区）到油水双连续区（bicontinuous，BC区）进而到水包油区（oil-in-water，O／W 区）的连续单相微乳区。以据此所配的系列微乳液为展开剂，23种氨基酸的薄层色谱结果见表2。


2.2 微乳色谱理论探讨

在微乳色谱中，溶质在固定相、油或水连续相及内核和界面等各相之间进行分配。色谱分析过程中，氨基酸分配在微乳液的内相或连续相处，也可穿插在界面上由CTAB与正丁醇组成的栅栏层中，另外吸附剂硅胶G也对其产生吸附作用，使其在与富集相的竞争中连续不断地脱附出来。由于吸附、分配、静电、疏水、立体、萃取与反萃取等可能的效应，导致各氨基酸迁移速率不同而使Rf值有所差异。



2.3 微乳液含水量对Rf值的影响

从表2可以看出，样品的Rf值随着微乳体系含水量的增加而增大。在薄层色谱分析中，Rf值主要受样品的极性、吸附剂的活度及展开剂的极性这三者的影响。当前二者恒定时，其Rf值主要受展开剂的极性控制。一般来说，展开剂极性愈大，Rf值也愈大。通过调节含水量，可获得适宜的展开体系。而微乳液含水量过高（大于60%），会使体系极性过大，导致许多斑点迁移至前沿线（湿线）边沿，且拖层严重，多数斑点形状不规则，可见微乳液的含水量以10%~60%为宜。在W／O型微乳液中，游离氨基酸进入水相（内核），得到富集增溶。在油水双连续相中，水既是增容相，又是连续相，游离氨基酸在两相均被适当富集；由于微乳液特殊的热力学稳定作用，使得富集氨基酸受多种效应影响，其中特定结构的氨基酸以特定速率被释放出来，从而得到较好的色谱效果。但如果水量过大，即O／W 型微乳液中，氨基酸主要进入连续相，这样微乳液的特点无法表现出来，此时则与普通极性展开剂无异。



2.4 氨基酸分子结构对Rf值的影响

样品极性越大，则被吸附剂吸附得越牢固，在相同条件下，迁移速率就越小。在主要结构相同（如表2中6#与2#，18#与17#氨基酸等）的条件下，分子中含OH 比不含OH 的氨基酸的Rf值要小。

值得一提的是，表2中15#与6#，17#与18#，20#与21#，15#与23#，它们的Rf值有些特殊，其值不仅与分子结构有关，而且还与微乳液的含水量有关。当含水量小于30%时，Rf（15#）>Rf（6#），Rf（17#）>Rf（18#），Rf（20#）>Rf（21#），Rf

（15#）>Rf （ 23#）；当含水量大于30%时，则刚好相反。6# 与15# 相比，前者含OH ，后者含SH ；17#与18#相比，20#与21#相比，后者比前者多OH ；而15#与23#相比，后者是前者的盐酸盐。总之，从分子结构上看，这些样品中后者的极性比前者强。一方面，当展开剂极性较低时，如含水量小于30%时，Rf值受分子极性控制；另一方面，当微乳液含水量较大时（大于30%），此时微乳液开始由W／O型向油水双连续型及O／W型转化，则Rf值不仅受分子极性、展开剂极性的影响，而且受静电、疏水、立体、萃取与反萃取等因素的影响，也可说随微乳液类型的转化，有的样品的Rf值变化大，有的变化小。



2.5 本法对氨基酸混合物的应用及与不同类展开剂的比较

对几种氨基酸的混合物，选择含水量40%的微乳液作展开剂，用同种氨基酸作对照，点样，展开结果表明其分离效果明显。

另外，按传统方法，采用CH3CH2OH，H2O与CH3COOH的混合液（体积比为50:50:1）为展开剂，与本法所用展开剂进行比较。结果表明前者展开后斑点大多不规则，且易产生拖尾现象，而本法则很少有这种情况。这说明，正是由于微乳液具有独特的结构，因此本法所用展开剂对目标分析物的色谱性能良好。