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hnkjzyj
第11楼2010/04/13
分子量不均一也能出这样的峰么？为什么？
因为DEAE-52分出来是三个峰，三个洗脱梯度分别是：蒸馏水、0.9%NaCl、0.375M NaCl，然后洗脱出来的三个组分的分子量分别为8、26、84KDa（数据是用Sepharose CL-6B来确定的），但是这个多糖组分用Sephadex G-100洗脱的话得到的还是一个峰形.....
用DEAE-52能分离开，是不是说明三种组分带电荷数不同???
同系物用凝胶柱分不开吧？柏坡(hgycook) 发表:就算分子量不均一也可能得出这样的色谱峰，多糖凝胶渗透色谱的分离模式决定了它能分离高分子，具有相同化学性质的同系物。可能这3中物质性能比较接近。
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hnkjzyj
第12楼2010/04/13
问题就出在：我三个峰是用离子交换柱给分开的，用凝胶柱Sephadex G-100 、Sepharose CL-6B、TSK这些分离的话得到的都是一个峰...而且，我G-100、CL-6B凝胶柱都是用0.9% NaCl洗脱的，应该不存在特异性吸附吧？
GPC跟HPLC不一样么？只不过是换了柱子罢了吧？？？？tigertooth(tigertooth) 发表:如果用别的柱子确实分出3个组分，而TSK的柱子只有一个峰，那么你的分离条件就可能有问题：柱子没分开，原因有多种，比如流动相条件不对，柱子选的不对，柱子和样品有相互作用、吸附等。而且看你的峰，峰型明显不对，GPC的峰肯定不会象普通HPLC峰那么窄，那么尖，就算分散度为1的标样，也不应想你的样品峰这样，最起码分子量低的没分好。看你样品的出峰时间，在根据溶剂峰的出峰时间，按道理讲，柱子的分离效果不应该很差，但后面的峰出的如此之快就不对。
所以分离条件肯定有问题，在如此差的分离下，怎么判断分子量很均一？
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hnkjzyj
第13楼2010/04/13
问题就出在：我三个峰是用离子交换柱给分开的，用凝胶柱Sephadex G-100 、Sepharose CL-6B、TSK这些分离的话得到的都是一个峰...而且，我G-100、CL-6B凝胶柱都是用0.9% NaCl洗脱的，应该不存在特异性吸附吧？
GPC跟HPLC不一样么？只不过是换了柱子罢了吧？？？？tigertooth(tigertooth) 发表:如果用别的柱子确实分出3个组分，而TSK的柱子只有一个峰，那么你的分离条件就可能有问题：柱子没分开，原因有多种，比如流动相条件不对，柱子选的不对，柱子和样品有相互作用、吸附等。而且看你的峰，峰型明显不对，GPC的峰肯定不会象普通HPLC峰那么窄，那么尖，就算分散度为1的标样，也不应想你的样品峰这样，最起码分子量低的没分好。看你样品的出峰时间，在根据溶剂峰的出峰时间，按道理讲，柱子的分离效果不应该很差，但后面的峰出的如此之快就不对。
所以分离条件肯定有问题，在如此差的分离下，怎么判断分子量很均一？
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hnkjzyj
第15楼2010/04/13
有几个问题，兄弟解释一下哈....O(∩_∩)O谢谢
1.GFC跟GPC应该是一样的吧？兄弟用的什么柱子？
2.宽标是什么？窄标又是什么？
3.GFC或者GPC，用标准曲线计算出来的是数均分子量还是重均分子量？
我用的标准品是葡聚糖标准品（哪买的忘了），分子量分别为1、5、12、80，270KDa，1KDa的好像不在TSK G-4000PWxl分离范围，所以我一般都是用5、12、150，270KDa做标准品，然后根据峰值时间做标曲，计算样品的分子量.....爱杰杰(zhchen1130) 发表:我们也是做GFC的 ，流动相用的是2.84%的硫酸钠，PH4.0，标准品为一个宽标标准品，数均分子量为3800，我们的样品峰也是一个单峰，楼主用的是宽标还是窄标呢？
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hnkjzyj
第17楼2010/04/13
谢谢....我的样品进去之后出来的峰形就是这样的，我就把它当做是分子量均一的组分了....
我的多糖是动物来源的，提取肯定有蛋白.....我用Folin-酚法测定蛋白含量为6%左右（用凯氏定氮测定是9%左右），多糖含量在40%，含有一部分硫酸根、糖醛酸之类的......
哪如果图谱有问题，这个图谱能说明什么问题呢？应该怎么改进？tigertooth(tigertooth) 发表:柱子不一样，填料不一样，分离效果有可能大不一样。
你的样品峰型有问题，前面象比较标准的GPC的峰，峰上去的很缓，但是从峰尖处下落就有问题了，下落的太快，就是单分散的标样也很难做到，而且一般自己得到的多糖不可能是单分散的，就是做标样的也没有单分散的多糖标样。所以我说峰型有问题，GPC和HPLC不一样的是如果得到的峰是馒头峰，那么一般问题不大，但如果是很尖很细的就要考虑考虑了。
而且你的样品只是多糖么，有没有糖蛋白、蛋白什么的，一般自己提的多糖大部分都有这些东西。
