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alian1210
第12楼2010/09/28
一般可将仪器的激发波长(Ex)先设定为200nm，然后进行发射波长(Em)模式扫描，(Em)波长范围暂设定为210－800nm，然后记录所有出现的峰值波长；改变激发波长(Ex)后再扫描，如第二次发射图谱中的某个（或某些）峰的位置没有位移（或位移很少），一般来说这个（或这些）峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高（或峰面积）发生改变。
将确定的荧光峰的波长作为发射波长(Em)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长（根据斯拖克斯定律）；如果仅出一个峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(Em)扫描，可以得到良好的信噪比的结果值；如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰，则需要作出选择，一般选择峰形高度适合并又有一定带宽的峰为激发波长。
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fragr
第14楼2010/10/02
未知样品测试选定激发和发射的最佳位置，需要一定的判断力。如果采用3D扫描当然是一个很好的快捷方式了。
如果没有呢？主要是经验了。
对于这位老兄的问题，主要是对荧光光谱仪的基本原理不明确。
1.最大 吸收峰并不代表激发峰-----因为不是吸收就能导致激发。但是吸收峰一定是可能的激发位置。
2. 测量荧光光谱----设定发射谱范围是需要回避激发波长位置的。所以你无法得到荧光峰，可能是被激发的一阶散射的强度掩盖了。
3. 不明白校正有效性的理由。
所以：这个方法来选取理由合理，方法需要细心考虑。主要是第二步的问题。liu22spoh(liu22spoh) 发表:先谢谢各位发言的大侠们！
这几天我就在做这个试验，不知道那是啥荧光物质。
之前没听说过荧光3d扫描，呵呵，还望各位告知一下都有那些品牌的相关仪器。
昨天用激发和发射光谱（300-700nm）的方式来做，发现问题很不少。
1，先在分光光度计上，检测全波长吸收曲线，发现在560nm处有最大的吸收峰，其他波长处基本上没有吸收，这是不是说明这个荧光物质的最大激发波长为560nm呢？
2，我权且把它的最大激发波长当作560nm，结果发现，检测发射光谱的时候，510nm-610nm这个范围之内的发生光均特别大，而峰值依旧在560nm，这是什么原因呢，因为反射光没有被屏蔽掉？我以490nm作为激发光，检测FITC的发射光谱，发现还是490nm两边的发射光信号呈正态分布。
3，为了确保仪器的有效性，我拿FITC做了一下扫描，以700nm作为发射光时，最大的激发波长为490nm；而以750nm为发射光时，最大的激发波长却不是490nm，偏差还蛮大的，这是什么原因呢？
还望大家不吝赐教啊！
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fragr
第15楼2010/10/02
因为氙灯在250nm及以下能力很弱，这样会导致很强的散射光虚假信号，所以不推荐选用250nm以下波长来尝试激发；
对于未知样品，楼上的方法是没有问题，只是建议首次选取的激发波长做些修改。比如350nm--300nm--260nm--400nm--450nm激发找到发射谱后来反推。这些只是个人的经验，供参考。alian1210(alian1210) 发表:一般可将仪器的激发波长(Ex)先设定为200nm，然后进行发射波长(Em)模式扫描，(Em)波长范围暂设定为210－800nm，然后记录所有出现的峰值波长；改变激发波长(Ex)后再扫描，如第二次发射图谱中的某个（或某些）峰的位置没有位移（或位移很少），一般来说这个（或这些）峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高（或峰面积）发生改变。
将确定的荧光峰的波长作为发射波长(Em)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长（根据斯拖克斯定律）；如果仅出一个峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(Em)扫描，可以得到良好的信噪比的结果值；如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰，则需要作出选择，一般选择峰形高度适合并又有一定带宽的峰为激发波长。
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夕阳
第16楼2010/10/02
应助达人请教15楼版友，假如样品的发射波长在250nm以下时，如何选择激发波长？
此外您为何选择“比如350nm--300nm--260nm--400nm--450nm激发找到发射谱后来反推”这个顺序和规律的？依据是什么？
谢谢！fragr(fragr) 发表:因为氙灯在250nm及以下能力很弱，这样会导致很强的散射光虚假信号，所以不推荐选用250nm以下波长来尝试激发；
对于未知样品，楼上的方法是没有问题，只是建议首次选取的激发波长做些修改。比如350nm--300nm--260nm--400nm--450nm激发找到发射谱后来反推。这些只是个人的经验，供参考。
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