第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

3.1 引言

3.1.1 多抗的制备原则

许多动物，如家兔、豚鼠、山羊、绵羊和小鼠等均能产生高亲和力的半抗原抗体。由于免疫测定只需要极少抗体(1 mL抗血清足以供数千次免疫测定使用)，因此对研究者而言，家兔是较合适的动物。家兔的饲养和操作方便，1只兔可采集近百毫升全血，能分离30～40 mL血清。家兔抗体中的IgG含量高，抗体比较均一。

半抗原一般为单价反应，因此对抗体的质量(亲和性和选择性)要求很高。根据抗体产生的动力学，相同抗原重复免疫是获得高效价抗血清所必需的。半抗原抗体，特别是高性能抗体的产生速度较慢。小剂量、低频率和长时间(10周以上)免疫注射应作为制备半抗原抗体的基本原则。

对于免疫程序，通常使用免疫佐剂将抗原制成油包水乳剂，以增强免疫原性、延长抗原作用时间和保护抗原不被破坏。首次免疫使用弗氏完全佐剂(Freurnd's completeadjuvant，含分枝杆菌死苗)，剂量为 0.1～1.0 mg/kg 体重，皮内多点注射；此后每隔 3～4 周加强免疫一次，免疫后期间隔适当延长，并且自第 3 次免疫后开始检查抗体效价(免疫注射后第 7～10 天)；一般持续免疫 8～12 周(免疫 3～5 次)后抗血清才可能达到较高的效价；最后一次加强免疫时剂量加倍，将纯抗原经肌肉或静脉注射方式免疫，第 7～10 天采血制备抗血清

3.1.2 本章研究目的和主要研究内容

本章通过动物免疫，获得抗 TAP 的多克隆抗体，并且对所获得的多抗进行纯化和鉴定。

1）将上章得到的完全抗原免疫兔子，获得含有抗体的血清；

2）将血清分离纯化得到多抗；

3）对多抗进行鉴定。第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

TAP-BSA，TAP-OVA偶联物用第二章方法制备。弗氏完全佐剂、弗氏完不全佐剂、吐温20(Tween 20)、聚乙二醇(PEG，MW1000)、四甲基联苯胺(TMB) 进口分装、羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)、邻苯二胺(OPD)均购于上海华美公司；新西兰长耳白兔(1.5-2kg)，无锡山禾药业实验动物中心； 聚苯乙烯酶联微孔板，Corning公司；甲砜霉素(TAP)、土霉素、氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素，这些药品均购自于sigma公司。

3.2.2 实验仪器

（1）冷冻干燥箱 E255Q 美国 FTS 公司

（2）酶标仪 MuLtiska Mks Thermo Labsystems 公司

（3）台式低速离心机 TGL－40B 上海安亭科学仪器厂

（4）电脑采集器 HD-A 南京大学仪器厂

（5）自动部分收集器 BSZ-100 上海精科实业有限公司

（6）恒流泵 HL-2B 上海精科实业有限公司

3.2.3 实验方法

3.2.3.1 抗体纯化

1. 饱和硫酸铵沉淀法

(1) 饱和硫酸铵溶液：取 500mL 蒸馏水，加热至 70～80℃，将 400g 硫酸铵溶于水中， 搅拌 20min，冷却。硫酸铵结晶沉于烧杯底部，上清即饱和硫酸铵。再用 28%氨水将饱和硫酸铵调节为 pH7.0。

(2) 0.0175mol/L pH6.4 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 ： NaH2PO4 · 2H2O 40.15g ；Na2HPO4·12H2O 33.22g，加蒸馏水至 2000mL,用时稀释 10 倍。

(3) 奈氏试剂：称碘化汞 115g，碘化钾 80g 加入不含氨的蒸馏水 500mL，溶解后过滤，滤液中加入 20%NaOH 500mL。

2. DEAE 柱层析法

DEAE 纤维素的处理

(1) 浸泡：取 DE-23 100g，加蒸馏水浸泡过夜，弃上清，加蒸馏水缓慢搅匀，浸泡 3 小时后，弃上清，加蒸馏水，如此反复洗泡 8 次，尽量弃去其中的碎末。最后，弃上清加少量蒸馏水，搅匀成糊状。

(2) 碱处理：将糊状物移入玻璃漏斗中，抽滤干后，倒入烧杯中，加 0.5mol/LNaOH 1500mL，轻轻的搅匀，置室温 40～60min，每 10min 搅拌 1 次。倾去上清液，再移入玻璃漏斗中，反复用蒸馏水洗滤至中性。

(3) 酸处理：碱处理后倒入烧杯中,加入 0.5mol/L HCl 1500mL,轻轻的搅匀，置室温 40～50min，每 10min 搅匀一次，弃上清后移入玻璃漏斗中，加蒸馏水反复滤洗至中性。重复碱处理。

(4) 泡洗：用蒸馏水浸泡 2d，期间换水 5 次。

(5) 平衡：用 0.0175 mol/L，pH6.4 磷酸盐缓冲液浸泡，每 15min 换液 1 次，直至洗出液的 pH 为 6.4 为止，可准备上柱。

3. 免疫亲和层析法

CNBr 活化的琼脂糖颗粒的处理主要依照 Amersham Biosciences 公司的说明书进行。

(1) 溶胀：称取 10gCNBr-Sepharose CL-4B 干粉慢慢倒入装有一定 1mmol/L

HCl 的洁净烧杯中，在 4℃溶胀 15min。

(2) 洗涤：在 G3 烧结玻璃漏斗上，用大约 2000mL 1mmol/L 的 HCl 反复洗

涤溶胀的 CNBr-Sepharose CL-4B。

(3) 交联缓冲液：0.1mol/L,pH8.3 的 NaHCO3 溶液，含 0.5mol/L 的 NaCl。

(4) 封闭缓冲液：1mol/L，pH8.0 的乙醇胺溶液。

(5) 醋酸缓冲液：pH4.0，0.1mol/L，含 0.5mol/L NaCl。

(6) Tris-HCl 缓冲液：pH8.0，0.1mol/L，含 0.5mol/L NaCl。

3.2.3.2 抗体鉴定

1. 免疫扩散法

15g/L 琼脂凝胶：100mL，pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到 1.5g 的琼脂内，水浴加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到 65℃左右时，加入0.1g 叠氮钠(NaN3)，使其于溶液中的浓度为 0.1%。

2. ELISA 法

(1)10×包被缓冲液(0.1mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液)

0.1mol/LNa2CO3 贮液：10.6g Na2CO3，三蒸水定容至 1000mL；

0.1mol/L NaHCO3 贮液：8.4g NaHCO3；三蒸水定容至 1000mL；

0.1mol/L Na2CO3 贮液 300mL 和 0.1mol/L NaHCO3 贮液 700mL 混合即可。

(2) 0.01mol/L ，pH7.4 磷酸缓冲液(PBS)NaCl 40g

KCl 1gKH2PO4 1gNa2HPO4·12H2O 18.1g三蒸水 300mL加热至 40℃，全部溶解后，冷却至室温，定容至 500mL，用时稀释 10 倍。

(3) 洗涤缓冲液(PBST)：含 0.05％Tween-20 的 0.01mol/L ，pH7.4 PBS。

(4) 封闭缓冲液：2g 卵清蛋白，用一定量 0.01 mol/mL ，pH7.4 的 PBS 溶液溶解，定容至 100mL，用纱布过滤。一般现配。

(5) 抗体稀释液：3g 白明胶，加入一定量的 0.2mol/mL ，pH8.5 的 PBST 溶液中，加热至 40℃，不断搅拌，全部溶解后，冷却至室温，定容至 1000mL。

(6) 显色液 1：A 液(0.01mol/L Na2HPO4)：17.8g Na2HPO4·12H2O，800mL 双蒸水溶解后，30% H2O2 20μL，定容至 1000mL，保存备用；B 液(0.1mol/L 柠檬酸－OPD)：柠檬酸 21.0g，OPD1.2g，双蒸水加至 1000mL。使用时，A 液与B 液等量混合均匀即可。

(7) 显色液 2： A 液：0.2mol/L Na2HPO425.7mL，0.1mol/L 柠檬酸 24.3mL，33μL30% H2O2，加蒸馏水至 100mL；B 液:10mgTMB 溶于 10mL 乙二醇。用时，10mL A 液与 0.4mL B 液混合即可。

(8) 2mol/L 的 H2SO4 终止液：三蒸水 177.8mL，慢慢滴入 98%的浓硫酸 22.2mL。

3.2.3.3 抗 TAP 抗体的制备[1-7]

1) 选择健康雄性 2 月龄新西兰白兔(体重 2～2.5kg)3 只，耳缘静脉采血，作为阴性对照；

2) 用生理盐水配制 TAP-BSA 溶液，用 Braford 法测定 TAP-BSA 中的浓度，并调整为 2mg/mL，分成 6 管，1mL/管，为免疫一次之用量。

3) 乳化：取 1 管上述 TAP-BSA 溶液，与完全或不完全佐剂 1mL 混合，用注射器反复抽拉，直至抽拉困难，滴至水面上 10min 不散开，即表示乳化成功。

4) 免疫：免疫程序按下表 3-1 进行。

表 3-1 免疫方案

Tab.3-1 The method of immunization

免疫次数 免疫原 免疫剂量 免疫部位

第一次 免疫抗原加入等量弗氏完全佐剂 1.0mL 后脚趾间隙

第二次 免疫抗原加入等量弗氏不完全佐剂 1.0mL 后腿股淋巴结

第三次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第四次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第五次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第六次 免疫抗原 1.0mL 后腿肌肉注射

第六次免疫一周后，在颈动脉采全血，置于塑料离心管。

3.2.3.4 抗血清分离

塑料离心管倾斜 50 度，静置于室温 4h，待血液凝固后，于 4℃冰箱中过夜，血清自然析出，将血清吸出，于 3000 r/min 离心 15min，取上清加入硫柳汞混匀，分装后于4℃冰箱中保存。

3.2.3.5 抗血清纯化

1. 饱和硫酸铵盐析法

(1) 盐析：取免疫兔血清 100mL，加入等量生理盐水，摇匀后，缓慢加入饱和硫酸铵溶液 200mL，边加边摇匀，充分混合后置 4℃冰箱内半小时以上。取出后离心，5000 r/min，20min。弃去上清液，加入生理盐水 100mL，溶解沉淀物后，加入 50mL 饱和硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达 33％，边加边摇匀，充分混匀，置 4℃冰箱内 40min。取出后离心沉淀，以 33％饱和度硫酸铵重复二次盐析。

(2) 脱盐：将离心后的上清液弃去，用少量生理盐水将沉淀物溶解，使其达到原血清量的 1/4 左右，装入透析袋中。以 0.0175mol/L pH6.4 磷酸盐缓冲液，4℃冰箱中透析 3 天，每天换液数次，每次 2000mL。后期用奈氏试剂测 NH4+，直至用奈氏试剂测不出铵离子为止，此时为粗提的 IgG。

2. DEAE-纤维素离子交换法

取装好的 DEAE 层析柱，用 pH6.4 的 PBS 液洗柱 1h，维持柱体积不变后，吸取上端 PBS 液，留下约 2mm 高的 PBS 液。粗提的 IgG 先离心，2000 r/min，10min，取上清液沿柱壁四周缓慢加入柱中，添加 2mL 离心后粗提的 IgG。打开柱下端口，流出一些液体，使样品慢慢进入柱床。待样品全部入柱时，添加少量 PBS，留少量 PBS 液于柱顶，关闭下端出口。静置 30min，加 PBS 于柱上，保持 PBS 液面在柱床以上，打开下端出口，调节流速至 20 滴/min，用收集管收集洗脱液。吸取少许洗脱液，用 20％磺基水杨酸钠测定是否已出现蛋白质，并用紫外分光光度计测 OD 值，将 OD 值高的各管洗出液合并，装入透析袋，用 30％的 PEG 浓缩透析液，可获得所需浓度的提纯 IgG。SDS-PAGE 法检测提纯效果。

3. 免疫亲和层析法[8,9]

(1) 称取 50mgBSA，溶于 10mL 交联缓冲液中。同时测 OD280。

(2) 用大约 2L 交联缓冲液，在 G3 玻璃漏斗中快速洗涤处理好的凝胶，洗涤后立即与 BSA 溶液混合。在摇床上，室温摇动 1h。

(3) 1000r/min 离心 5min，测上清液的 OD280，按下面的公式计算交联率：交联率＝(上样前的 OD280－上清液的 OD280)/上样前的 OD280

(4) 用大约 10L 交联缓冲液，反复洗涤凝胶。

(5) 将凝胶转移至封闭缓冲溶液中，在摇床上，室温摇动 2h。

(6) 用醋酸缓冲液和 Tric-HCl 交替洗涤凝胶 4 次。

(7) 洗涤好的凝胶上柱，用 100mL 交联缓冲液平衡亲和柱。第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

(8) DEAE 纯化抗血清在交联缓冲液中透析 2h。取 3mL 上样，用交联缓冲液洗脱，流速 1mL/min，通过紫外检测仪检测，至基线平稳为止。

(9) 洗脱液于 4℃，pH7.4 的 PBS 缓冲液中透析 2d，多次换液。冷冻干燥浓缩后与等量甘油混合，分装，-20℃储存。间接 ELISA 法检测提纯效果。

（10）解吸附：用 pH2.8，0.2mol/L 的甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱。

（11）层析柱再生：用100mL，0.1mol/L，pH8.5的Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)和100mL，0.1mol/L，pH4.5 的醋酸钠缓冲液(含 0.5 mol/L NaCl)，交替洗涤 3 次。再用交联缓冲液平衡(含 0.02%的 NaN3)，4℃冰箱储存。

3.2.3.6 抗血清的鉴定

1. 琼脂双向免疫扩散法[10]

(1) 浇板：用 5～10mL 吸管吸取溶化的 15g/L 的琼脂凝胶，于一张洁净载玻片的后1/3 处浇注，约 3mm 厚，使琼脂凝胶均匀布满玻片，不能有气泡。

(2) 打孔：待凝胶凝固后，用打孔器打孔。

(3) 加样：一块玻片的中央孔内加入 1︰32 稀释的阳性抗血清，另一玻片的中央孔内加入同样稀释的阴性抗血清，周边 6 孔分别添加 TAP-OVA，TAP，TAP-BSA、BSA，OVA，PBS。

2. SDS-PAGE 法检测 DEAE-纤维素纯化效果浓缩胶浓度为 4%，分离胶为 12%，200v 恒压，开始电流 100mA，终止电流 60mA，45min 走完。考马斯亮蓝染色 30min，脱色 1h。

3. 间接 ELISA 法检测亲和层析效果

(1) 0.2g/L 的 BSA 溶液(包被缓冲液溶解)包被 96 孔酶标板，100μL/孔，4℃冰箱过夜。次日，从冰箱内取出，室温回温 30min，每孔注入 200μL PBST，在摇床上振荡 3min 后，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤 2 次。下面的洗涤方法相同。

(2) 充分洗涤后，用 20g/L 的 OVA 溶液封闭酶标板，200μL/孔，37℃ 2h。

(3) 取 6 条酶标板条，第 1 行加抗体稀释液作为空白对照；第 2 行加 1:1 000 稀释的阴性血清；3 条板条加入 1︰40000、1︰80000 稀释的过 DEAE 柱但未过亲和柱的抗血清(DEAE-Ab)，另 3 个板条加入 1:10000、1:20000 过免疫亲和层析柱的抗血清(IA-Ab)，100μL/孔，每个浓度均为 9 个平行孔。

(4) 依次加入 HRP-IgG 和显色液 1，均为 100μL/孔，每一步均经过洗涤和温育。

(5) 最后，用 2mol/L H2SO4 终止反应，于波长 450nm 测定吸光度(OD)值。

4. 抗体含量的测定

分别将亲和层析纯化血清稀释至适当的浓度，分别测 260nm 和 280nm 的吸光度，按公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度(mg/mL)=1.45 OD280nm－0.74 OD260nm

5. 抗体亲合常数的测定(间接非竞争 ELISA 法)[11-15]

(1) 包被缓冲液将 TAP-OVA 溶液按 1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/1600、1/3200、1/3200、1/6400、1/12800 的比例稀释后，100μL/孔包被 96 孔酶标板，4℃冰箱过夜。(2) 洗涤封闭后，加入系列稀释的已知浓度的过亲和层析柱的抗体，100μL/孔，每个浓度设 3 个平行孔，37℃温育箱内 2h，同时设空白对照孔。

(3) 按前面介绍的方法加 HRP-IgG 、显色液 1、终止液及测定。

(4) 以抗体浓度的对数为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，每个包被浓度均可作一条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的 OD 值为 100%，查出各曲线 OD 值为 50%所对应的抗体浓度[Ab]t, [Ab]′t，[Ab]″t，[Ab]″＇t，根据公式 Ka=(n-1)/2(n[Ab]′t－[Ab]t)，

3 个 Ka 值的平均值为抗体的亲和常数。

6. 间接 ELISA 法测定抗血清效价

用包被抗原 TAP-OVA 交联物包被酶标板，用 PBS 稀释抗血清及酶标二抗，进行间接 ELISA 。抗血清按 1︰100、1︰1000、1︰10000 … … 倍比稀释，每个浓度设两个平行孔，利用阳性－阴性比率(P/N)法进行判断，以 P/N>2.1 为阳性。为避免阴性血清大比例稀释后吸光值过低，使测定比值无实际意义，阴性血清以 1:1000 稀释。

操作步骤

（1）将抗原用包被液稀释成适当浓度，以每孔 100μL 的量加入酶联反应板中；

（2）放入 37℃温箱中 2h 或 4℃冰箱中过夜，取出后倒掉余液并用 200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次 3min，之后拍干；

（3）每孔加入 200μL 的封闭液放入 37℃温箱 2h，取出后直接拍干；

（4）每孔加入 100μL 稀释血清，放入 37℃温箱 30min，取出后洗涤同上，拍干；

（5）每孔加入 100μL 的一定浓度的酶标二抗(说明书推荐浓度)，放入 37 ℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；

（6）每孔加入 TMB 溶液 100μL，之后放入 37℃温箱 15min，取出后每孔加入 100μL终止液，并用酶标仪中测定光密度（optical density, OD）值。

（7）测定 OD 值。

以上每一步均经 PBST 溶液洗涤 3 次，3min/次。以 OD450为纵坐标，抗体稀释倍数的负对数为横坐标作图，当 OD 值大于或等于阴性对照孔的 2.1 倍（即 P/N≧2.1）并且OD 值大于 0.2，此时血清的稀释倍数为血清的效价。

7. 抗体特异性的鉴定

方法同上 6，但抗体抑制物分别采用甲砜霉素（TAP）、土霉素、氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素进行竞争 ELISA。

根据下列公式计算交叉反应率：

交叉反应率（%）= 引起 50%抑制的 TAP 的浓度/引起 50%抑制的类似物的浓度×100

3.3 结果与讨论

3.3.1 抗体纯化分析

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质，此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可以利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最广。DEAE-纤维素阴离子交换法是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸铵沉淀法联合使用可以非常有效的纯化抗体。DEAE 是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过 DEAE 柱时，带负电荷的蛋白质可以被 DEAE 吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出，纯化抗体时刻选择 pH 值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷，使之吸附在 DEAE上面，然后用增加盐度的方法将抗体洗脱。经过两次处理的抗体，还含有抗 BSA 的抗体，此时可以选择通用免疫亲和层析法除去抗 BSA 的抗体，得到单一的抗 TAP 的抗体。

3.3.1.1 双向免疫扩散法检测结果分析

从图 3-1 可以看到，抗血清既可以和 TAP-BSA 与 BSA 反应形成可见的沉淀线，也可以与 TAP 和 TAP-OVA 反应形成可见的沉淀线，而不与 PBS 及 OVA 反应形成可见的沉淀线，可以推知抗血清中不仅含有针对 BSA 的抗体，同时，也含有针对 TAP 的抗体。

图 3-1. 抗血清的双向免疫扩散图

Fig.3-1 Double direction immunodiffusion 1.PBS ;2.BSA; 3.TAP-BSA; 4.OVA ;5.TAP-OVA; 6.TAP；

Middle core: antiserum diluted by 1:32

3.3.1.2 DEAE-纤维素纯化抗体结果分析

图 3-2 的 SDS－PAGE 图中，1、2 泳道的样品分别为经过饱和硫酸铵沉淀未经 DEAE柱的抗血清和经过 DEAE 柱的抗血清。从图中可以看到，未经 DEAE 柱的抗血清电泳出现多条蛋白条带，说明经过盐析后的抗血清中杂蛋白仍然比较多。而经过 DEAE 柱层析的抗血清电泳仅出现 1 条条带，参照相关文献，此条带应该为集中的免疫球蛋白。

也说明 DEAE 柱层析纯化抗体取得预期的效果。但是纯化后的抗血清中仍然含有针对BSA 的抗体，为了得到单一特异性的抗体，必须经过亲和层析柱，将抗 BSA 的抗体结合在柱上。

图 3-2 抗血清的 SDS－PAGE

Fig.3-2 The SDS－PAGE of serum

3.3.1.3 间接 ELISA 法检测亲和层析纯化抗体结果分析

表 3-2 间接 ELISA 法检测纯化抗体

Tab. 3-2 The result of purified antibody by ci-ELISA

血清

类型

空白

血清 阴性血清 未经亲和柱的血清 经过亲和层析的血清

稀释度 未稀释 1﹕1000 1﹕40000 1﹕80000 1﹕10000 1﹕20000

吸光度 0.101 0.235 2.563 2.498 0.302 0.285

从表 3-2 可以看到，虽然经过亲和层析的血清稀释倍数比未经亲和层析的血清稀释倍数小，但其吸光度却远小于未经亲和层析抗体的吸光度，与阴性血清的吸光度相差无几，说明抗血清中针对 BSA 的大 部分抗体被吸附到亲和层析柱上，也即收集的过亲和层析柱的抗血清为针对 TAP 的单一特异性的抗体

3.3.1.4 抗体亲和常数测定结果分析

抗体稀释倍数[log(1/[Ab])]

光吸值度Ag1 Ag2 Ag3

图 3-3 亲和常数测定图

Fig.3-3 Determination of affinity constant by indirect ELISA第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

45

用紫外分光光度计测得抗体在 280nm 和 260nm 波长处的吸光度分别为 2.853 和

2.604，用公式计算即得抗体浓度为 2.21mg/mL。抗体分子量以 1.6×105 计算。从图 3-3

可以查得不同包被浓度下，对应 OD50%时抗体的浓度，根据抗体亲和常数计算公式可求得 TAP 抗体的平均亲和常数为 7.8×10-9mol/L。

3.3.1.5 间接 ELISA 法测定抗血清效价结果分析

表 3-3 血清效价测定

Tab.3-3 ELISA titers of serum

血清稀释倍数 阴性 空白

102 105 106 107 108 109 103

吸光度 2.635 2.602 1.621 0.286 0.086 0.062 0.232 0.065

表 3-3 为抗体稀释倍数的对数对相应吸光度的值。1:1000 稀释的阴性血清平均 OD值为 0.23 左右。阳性血清稀释到 106倍时，此时 OD 值与于阴性血清的 OD 值之比为 7，当此比值大于 2.1（即 P/N≧2.1）并且 OD 值大于 0.2，此时血清的稀释倍数为血清的效价。所以抗体的效价大概为 1×106 以上。抗体效价的测定随测定条件和判定标准的不同而不同。

3.3.1.6 抗体特异性分析

采用间接 ELISA 测定方法，根据公式计算的到抗体和 TAP 结构类似物的价差反应率，结果显示出与氯霉素少有交叉反应之外，与其他化合物并无反应。说明抗体的特应良好。

结果见表 3-4。

表3-4 抗体与其它抗生素的交叉反应率

Tab. 3-4 Cross-reactivity of TAP antiserum with other antibiotics

抗生素 交叉反应率%

氯霉素 0.4

泰乐菌素 <0.01

链霉素 <0.01

四环素 <0.01

土霉素 <0.01

青霉素 <0.01

红霉素 <0.01

庆大霉素 <0.01

新霉素 <0.01

卡那霉素 <0.01

3.4 本章小结

1. 通过免疫兔子，制备得到了抗 TAP 的特异性抗体，并且通过饱和硫酸铵沉淀，DEAE柱层析和免疫亲和层析法对抗体进行了纯化。

2. 通过 ci-ELISA 方法对抗体的效价，亲和常数和特异性进行了鉴定。抗体的效价达到了 1×106以上，亲和常数为 7.8×10-9mol/L。抗体除与氯霉素有轻微的交叉反应外，无明显交叉反应

第四章 ELISA 方法的建立与优化

4.1 引言

4.1.1 免疫分析简介

免疫分析(immunoanalysis)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键范德华力和疏水区域的综合作用，因而具有单独任何 一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度,非常适用于复杂基质中痕量组分的分离和检测。 兽药残留免疫分析方法的建立包括以下方面的内容：待测物选择、免疫半抗原合成、结合抗原合成、抗体制备、测定方法、样本前处理方法和方法评价。根据半抗原载体现象合成结合抗原、制备抗体和建立免疫分析方法已成为各种小分子免疫分析的基本模式。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是当前应用最广、发展最快的固相酶免疫测定技术。一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度法进行检测。国内外已有ELISA专用的比色计(酶联免疫检测仪)出售，高档仪器带有曲线拟合等数据处理软件，使用方便。

4.1.2 本章研究目的和主要内容

通过前几章的研究，得到了高特异性的抗体。本章根据 ELISA 原理，建立 TAP 的快速检测方法。主要研究内容：

1） ELISA 检测方法的建立；

2） ELISA 检测方法的优化。

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

TAP-BSA，TAP-OVA 偶联物用第二章方法制备。抗体用第三章方法制备。 聚苯乙烯酶联微孔板，Corning 公司；吐温 20(Tween -20)、聚乙二醇(PEG，MW1000)、四甲基联苯胺(TMB) 进口分装、羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)、邻苯二胺(OPD)均购于上海华美公司。新鲜鱼，购于青山菜市场。

4.2.3 主要仪器

（1）冷冻干燥箱 E255Q 美国 FTS 公司

（2）酶标仪 MuLtiska Mks Thermo Labsystems 公司

（3）台式低速离心机 TGL－40B 上海安亭科学仪器厂

（4）分析天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

（5）酸度计 DELTA320-S 梅特勒-托利多（上海）

4.2.4 主要溶液

1) 包被缓冲液 (0.05mol/L，pH9.6)

Na2CO3 1.59g

NaHCO3 2.93g

加蒸馏水至1000mL

2) 封闭液

卵清蛋白(OVA) 2.00g

包被缓冲液 100mL

3) 洗涤液 (0.01 mol/L，pH7.4)

NaCl 8.00g

KCl 0.20g

KH2PO4 0.20g

Na2HPO4·12H2O 2.9g

Tween-20 0.5mL

加蒸馏水至1000mL

4) 稀释液

明胶 0.10g

洗涤液 100mL

5) 终止液 (2 mol/L H2SO4)

浓硫酸（98%） 22.2mL

蒸馏水 177.8mL

6) 底物缓冲液

Na2HPO4·12H2O 9.2g

柠檬酸 2.55g

加蒸馏水至500mL

7) TMB底物测定液

TMB储存液(4.2mg溶于10mL乙二醇)2mL，底物缓冲液10mL，30% H2O2 1.9μL。临用时新鲜配制。

8) PBS (0.2 mol/L，pH6.7)

Na2HPO4·12H2O 3.12g

NaH2PO4·2H2O 1.76g

加水至100mL

9) PBS (0.0175 mol/L，pH7.0)

87.5mL PBS（1.1.4.8），加水定容至1000mL。

10) 显色液 1：A 液(0.01mol/L Na2HPO4)：17.8g Na2HPO4·12H2O，800mL 双蒸水溶解后，30% H2O2 20μL，定容至 1000mL，保存备用；B 液(0.1mol/L 柠檬酸－OPD)：柠檬酸 21.0g，OPD1.2g，双蒸水加至 1000mL。使用时，A 液与 B 液等量混合均匀即可。

11) 显色液 2: A 液：0.2mol/L Na2HPO425.7mL，0.1mol/L 柠檬酸 24.3mL，33μL 30%H2O2，加蒸馏水至 100mL；B 液：10mgTMB 溶于 10mL 乙二醇。用时，10mL A液与 0.4mL B 液混合即可。

4.3 实验方法

4.3.1 ELISA 方法的建立

4.3.1.1 酶标板的选择[1-3]

以下测定的显色液均为显色液 2，抗体均为 Ig-Ab 抗体。

各种板的性能的检测(粗筛)

(1) 包被：随机抽取进口板和国产板各两块，用 pH9.6，0.01mol/L 的碳酸盐缓冲液1:1000 稀释的羊抗兔 IgG 包被，100μL/孔。4℃冰箱过夜。

(2) 洗涤：次日将板从冰箱中取出，回至室温，弃去孔内的液体，用 8 道移液器添加洗涤缓冲液 200μL/孔，在摇床上振荡 3min，再弃去孔内的液体，在吸水纸上

用力拍干；同法洗涤 3 次。

(3) 封闭：每孔加 200μL 封闭液，室温(Room Temperature 室温)温育 2h 后，洗涤，拍干。

(4) 加酶标二抗：用抗体稀释液将 HRP-IgG 按 1:1000 稀释，100μL/孔，37℃湿盒温育 30min，同上法洗涤，拍干。

(5) 加显色液，100μL/孔，室温温育 15min。

(6) 显色测定：加终止液 100μL/孔，终止反应后，在酶标仪上测 OD450 值。

计算同一板的孔间变异系数（CV）和板与板之间的 CV。孔间 CV 应小于 5%。板间差异采用 t 检验来评价，同时参考价格因素和来源等因素来决定板的取舍。

4.3.1.2 HRP－IgG 工作浓度和显色液中 H2O2 浓度的确定

(1) 包被：用 pH9.6，0.01mol/L 的碳酸盐缓冲液 1﹕1000 稀释羊抗兔 IgG，100μL/孔包被，4℃冰箱过夜。

(2) 按 1﹕500，1﹕1000，1﹕2000，1﹕3000，1﹕4000 的比例稀释 HRP-IgG，100μL/孔，每个浓度 2 列 16 个孔，室温温育 30min。第 1 列及 12 列加抗体稀释液，为空白对照。

(3) 添加 H2O2 浓度分别为 0.1%，0.05%、0.01%、0.005%的显色液，100μL/孔，每个浓度 2 行 24 孔。选择室温 20min，吸光度在 1.2 左右的稀释浓度为 HRP-IgG的工作浓度，此时 H2O2的浓度为显色液中 H2O2的工作浓度。

4.3.1.3 包被抗原、一抗的工作浓度的确定[4]

(1) 包被：用包被缓冲液将包被抗原 TAP-OVA 系列稀释(1﹕1000~1﹕8000)，包被酶标板，每个浓度 1 行，12 孔，100μL/孔，4℃冰箱过夜；

(2) 加抗血清(一抗)：用 PBST 溶液系列稀释抗体储液(1﹕100~1﹕500)，按稀释顺序加入到酶标板中，每个浓度加 2 列，共 16 个孔，室温温育 30min。

(3) 其它步骤均如前述。

选择 A 值为 1.0 左右时的包被抗原和一抗的稀释度作为工作浓度。

4.3.1.4 操作步骤

（1）将抗原用包被液稀释成适当浓度，以每孔100μL的量加入酶联反应板中；

（2）放入37℃温箱中2h或4℃冰箱中过夜，取出后倒掉余液并用200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次3min，之后拍干；

（3）每孔加入200μL的封闭液放入37℃温箱2h，取出后直接拍干；

（4）每孔加入100μL稀释血清，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，拍干；

（5）每孔加入100μL的一定浓度的酶标二抗，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；

（6）每孔加入TMB溶液100μL，之后放入37℃温箱15min，取出后每孔加入100μL终止液，并用酶标仪中测定光密度(optical density, OD)值。

（7）测定OD值。

4.3.2 ELISA 方法的优化[1-3]

4.3.2.1 包被时间的选择

用选定的包被溶液将包被抗原稀释至最适浓度，同时包被数块酶标板，每孔100μL分别置于37℃1h、37℃1.5h和37℃2h，评价不同包被时间对IC50影响，考察其对IC50的影响,确定最佳包被、封闭时间。

4.3.2.2 封闭液的选择

分别采用1%明胶以及2%的OVA作为封闭液。并进行比较，进一步确定明胶的浓度以及稀释液的PH。

4.3.2.3 封闭时间的选择

37℃下将封闭时间分别设为1h，2h和2.5h，考察其对IC50的影响。

4.3.2.4 最优温育时间和温度的确定

工作浓度稀释的一抗和 TAP 标准液在竞争步骤之前混合在一起，然后在不同温度

下预温不同时间：4℃冰箱中过夜、室温下 1h 和 0h，然后分别添加到板中，在室温下，分别温育 5、15、30、60 和 120min。最后按前面介绍的步骤洗涤，测定。

4.3.2.5 PBS浓度的选择

改变PBS缓冲液的浓度分别为0.05、0.02、0.01、0.005mol/L，考察盐浓度对IC50的影响。

4.3.2.6 Tween-20最优浓度的确定

用含不同浓度Tween-20(1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001%)的PBS溶液稀释抗体(一抗和二抗)，配制TAP标准溶液，同时在一块酶标板上测定。

4.3.2.7 抗体工作液pH值的选择

按上述已选定的ELISA反应条件，将抗体工作液的pH值调为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5和10.5，考察pH值对IC50的影响。

4.3.2.8 二抗反应时间的选择

将二抗反应时间分别设为15min、20min和25min，考察其对IC50的影响，确定最佳酶标二抗的反应时间。

4.3.2.9 显色时间的选择

将显色时间分别设为10min、15min和30min,考察其对IC50的影响，确定最佳显色时间。

4.3.2.10 TMB储存液与底物缓冲液比例的确定

将TMB储存液与底物缓冲液按1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8的比例混和，考察其对IC50的影响，以选择最佳的比例。

4.3.2.11 TAP 与抗体体积比的选择

将TAP标准溶液与抗体体积比分别选择为20﹕80、30﹕70、40v60、50﹕50、60﹕40、70﹕30和80﹕20，考察其对IC50的影响，确定最佳NT标液与抗体的体积比。

4.3.2.12 标注曲线的建立

建立竞争ELISA方法以检测药品对抗体的抑制反应。具体操作步骤同4.3.1.4，但是包被抗原和抗体为工作浓度，并且在加入抗体的同时，加入标准品稀释液，其浓度分别为0ng/mL、0.35ng/mL、0.7ng/mL、1.05ng/mL、2.1ng/mL、4.2ng/mL、8.4ng/mL、16.8ng/mL、

33.16ng/mL，做标准曲线。

4.3.2.13 ELISA灵敏度实验

以OD-2SD公式法计算灵敏度。零空白同时做10个，利用统计学原理对结果进行处

理，得出灵敏度。