第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

5.1 引言

5.1.1 药物残留分析简介

残留分析属于一种多学科交叉的方法学领域，分析对象和样品基质复杂，几乎所有

的分析理论和技术在残留分析中都得到了研究与应用，但色谱分析法一直占据主导地

位。纵观 20 多年来残留分析乃至整个分析化学领域的发展过程，检测限是残留分析方

法使用中最主要的限制因素，追求高灵敏和高分辨(分离)是分析方法发展的两个基本主

题。随着药物结构的日益复杂化、低剂量化和样品数量的增多，提高对这些物质的分析

能力和分析效率是残留分析的重要发展方向。各种现代色谱分析技术，如 HPLC、GC、

HPTLC 和 CE 都是典型色谱-波谱的联用技术，是残留分析中最重要和最基本的测定手

段。20 世纪 80 年代以来 HPLC 一直是残留分析的基本方法。GC/MS 是目前应用最活

跃的联用技术和成熟的残留确证分析技术，有种类齐全的标准 EI 谱库供计算机自动检

索。除去价格因素之外，理论上LC/MS是相当完善的联用技术。HPLC作为MS或MS/MS

的进样系统，MS 也可被看作 HPLC 通用和高灵敏的检测器，是分离、结构鉴定和定量

一次完成，从而实现对形形色色物质的确证分析。现在对研究甲砜霉素残留的检测研究

论文很少，国内的更少，检测方法主要有 HPLC[1-4]， HPLC/MS/MS[5-6]，GC[7-10]，

GC/MS[11-12 ] 。

5.1.2 本章研究的目的和主要内容

ELISA 方法只能做为筛选的方法，检出的阳性结果还必须用仪器分析的方法来最后

鉴定。本章主要研究甲砜霉素残留的高效液相色谱，高效液相色谱质谱联用，气相色谱

质谱联用三种仪器检测方法。本章的主要研究内容：

1）甲砜霉素残留的提取净化方法研究；

2）甲砜霉素残留的高效液相色谱，高效液相色谱质谱联用，气相色谱质谱联用方法的

建立；

3）气相色谱质谱联用方法的优化。

5.2.3.3 实验条件

1）气质联用

色谱柱：HP-5MS，30 m × 0.25 mm id ×0.25μm。色谱条件：载气为高纯 He，流量 1 mL/min；不分流进样，进样量 1.0 μL；进样口温度 250℃；温度梯度：1 00 ℃(1min) 程序升温 30℃/min ，280℃(3 min)。质谱条件：质谱采用 NCI 离子源，选择 m/z409、411、499、501 进行选择离子检测（SIM）测定。在全扫描（SCAN）模式中，m/z的扫描范围为 150～500。

2）液质联用

色谱柱：XTerra? MS C18 3.5μm，2.1×150mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 0.2 mL/min；柱温 30℃；进样量 10μL。质谱条件：质谱采用 ESI 离子源，MRM 检测离子： 354/185(19eV),354/290(12eV), 每个离子检测时间：0.2s，毛细管电压： 3.00kV，锥孔电压： 80V，去溶剂温度：350℃锥孔气流：100L/hr，去溶剂气流： 500L/hr，碰撞气体为氩气，碰撞气压： 2.6×10-4 Pa。

4）高效液相色谱

色谱柱：XTerra? MS C18 5μm， 4.6,1×250mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 1 mL/min；柱温 30℃；进样量20μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为：224nm。

5.2.3.4 样品添加回收实验

取 10g 均质的样品于 50mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，按 4.5，18.0，9.0，45.0，90.0 浓度添加标准溶液，混匀，起去操作同 5.2.3.2。

5.2.3.3 实验条件

1）气质联用

色谱柱：HP-5MS，30 m × 0.25 mm id ×0.25μm。色谱条件：载气为高纯 He，流量 1 mL/min；不分流进样，进样量 1.0 μL；进样口温度 250℃；温度梯度：1 00 ℃(1min) 程序升温 30℃/min ，280℃(3 min)。质谱条件：质谱采用 NCI 离子源，选择 m/z409、411、499、501 进行选择离子检测（SIM）测定。在全扫描（SCAN）模式中，m/z的扫描范围为 150～500。

2）液质联用

色谱柱：XTerra? MS C18 3.5μm，2.1×150mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 0.2 mL/min；柱温 30℃；进样量 10μL。质谱条件：质谱采用 ESI 离子源，MRM 检测离子： 354/185(19eV),354/290(12eV), 每个离子检测时间：0.2s，毛细管电压： 3.00kV，锥孔电压： 80V，去溶剂温度：350℃锥孔气流：100L/hr，去溶剂气流： 500L/hr，碰撞气体为氩气，碰撞气压： 2.6×10-4 Pa。

4）高效液相色谱

色谱柱：XTerra? MS C18 5μm， 4.6,1×250mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 1 mL/min；柱温 30℃；进样量20μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为：224nm。

5.2.3.4 样品添加回收实验

取 10g 均质的样品于 50mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，按 4.5，18.0，9.0，45.0，90.0 浓度添加标准溶液，混匀，起去操作同 5.2.3.2。

表 5-5 三种仪器不同浓度的检测结果

Tab.5-5 The result of various concentration by three apparatus

仪器 添加浓度

(μg/kg) 平行 平(均%)值 R(%SD)

1 2 3 4 5

0.1 0 0 0 0 0

HPLC10 71.8 78.2 85.5 72.9 84.6 78.6 7.4

20 87.4 101.5 99.1 91.3 97.7 95.4 5.9

0.1 69.2 72.9 78.1 68.6 77.2 72.6 4.5

HPLC/MS10 89.6 93.1 98.5 97.3 93.4 95.4 3.7

20 96.5 101.5 96.2 102.6 100.2 99.8 2.5

0.1 80.7 89.6 83.6 87.5 88.6 85.6 3.7

GC/MS10 90.8 102.5 93.7 97.1 101.4 97.6 5.0

20 100.8 97.3 105.6 103.8 104.1 101.5 3.4

5.3.2.3 仪器分析方法图谱

1）气相色谱定性、定量检测甲砜霉素

从甲砜霉素高效液相色标准品和加标样品的色谱图可以看出，二者在鱼上的保留时间是一致的，如果样品中的残留药物是未知的，这种方法不能作为定性的依据，还要通过别的方法做确证实验。在本实验中，对浓度为 1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小于 3% ，符合定量要求。

图 5-7 甲砜霉素标准品的 HPLC 图

Fig.5-7 The HPLC-spectrogram of thiamphenicol

图5-8 加标样品的色谱图(10μg/kg)

Fig.5-8 The spectrogram of fortified sample（10μg/kg）

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。经提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回收率，其结果见表 5-5。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小于 10%。

2) 气相色谱-质谱定性、定量检测甲砜霉素

甲砜霉素的化学性质比较稳定，熔点比较高，不容易气化，甲砜霉素分子中含有两个羟基，可以通过衍生化以提高其挥发性，用负化学电离源检测，灵敏度较高。甲砜霉素的衍生化产物以及其衍生物的质谱图见图 5-9。从甲砜霉素衍生物的质谱图上可以看出， 409、411、499、501 这四个离子特异性较强。在本实验中，对浓度为1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小于 3% ，符合定量要求，因此选择这四个离子作为选择离子。

图 5-9 甲砜霉素衍生物的质谱图F

图5-10 加标样品的色谱图(10μg/kg)

Fig.5-10 The spectrogram of fortified sample（10μg/kg）

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。经提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回收率，其结果见表6。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小于10%。

3) 液相色谱-质谱定性、定量检测甲砜霉素

在 LC/MS 检测方法中，多采用 ESI(-)方式。负离子方式可以提供较正离子方式更多的碎片信息。本研究采用负离子方式。从甲砜霉素的质谱图上可以看出，除分子离子峰外，185、240、270、290 这四个离子特异性较强。在本实验中，对浓度为1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小于 3% ，符合定量要求。

图 5-11 甲砜霉素的质谱图

图 5-12 加标样品的LC/MS色谱图

Fig.5-12 The LC/MSspectrogram of fortified sample

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。经提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回收率，其结果见表5-5。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小于10%。

第六章 甲砜霉素残留在鲈鱼体内的消除规律

6.1 引言

6.1.1 药代动力学简介

药代动力学是指导正确使用药物，提高用药合理性与有效性的一门应用基础学科。鉴于水产药物的应用现状，药物代谢动力学及组织动力学在水产业的应用，通过确定药物在动物体内的吸收、代谢、排泄等代谢动力学基本参数，确定药物准确疗程，包括：剂量大小，给药间隔时间长短，给药方法，连续给药次数，以及休药期；为临床用药提供理论依据，有助于指导合理用药，使药物充分发挥疗效又避免或减少副作用的发生。可望从根本上解决上述弊病。根据药动学原理，达到治疗效果的有效血药浓度及有效血药浓度维持时间与药物种类、实验动物（大小、状况）、给药方式都有直接关系，所以，当经过药效学实验确认一种药物为某种病原体的敏感药物后，还必须通过该药物的药动学研究，才能确定合理给药方案。不同动物之间或任意药物之间给药方案或临床应用的随意移植都是违反药动学原理的。近年来，我国科研工作者已经开始重视渔药临床应用及水产药动学研究，中国水产科学研究院黄海水产研究所从1994 年开始受农业部的委托先后进行了“水产养殖防治病药物效果对比筛选试验”和“渔药药代动力学及对环境影响研究”等项目的研究工作，对目前常用渔用药物的药效、毒理及对养殖生态环境的影响等方面内容进行了较深入的研究，现已取得显著成果，对改善渔药应用现状起到积极的促进作用。为迎接入世挑战，国内已逐步开始推行HACCP（危害分析及关键点控制）计划。特别是我国加入WTO 以后，经济贸易需要与世界接轨，各项管理规定必须符合国际要求，才能与世界各国顺利发展贸易关系。然而，近年来频频发生的“贸易壁垒”事件给我国对外贸易造成巨大损失，主要原因在于我国的动物源性食品药物残留超标，使其贸易出口受到巨大压力。药动学原理在水产业的应用，有利于制定正确给药方案，以规范水产动物疾病临床用药；对水产品中药物残留实行有效监控，以保护生态环境、保证食用者健康，杜绝药残超标事件发生；以加快我国实现从传统渔业向无公害渔业的转变及实现水产养殖业的可持续发展。

6.1.2 本章研究的主要目的和主要内容

随着水产养殖业发展，养殖水域污染不断加剧, 导致水产动物的病害问题日益突出。生产中，很多抗菌药物被用来治疗各种水产动物疾病。然而，渔药使用多是凭经验或借鉴人畜的用药方法，具有很大的盲目性,影响了药物的疾病防治效果；另外留降低了水产品的品质，严重威胁着食用者的健康。因此，进行渔用抗菌药物的药动学以及残留研究，具有重大的理论和现实意义。本章主要研究 TAP 在鲈鱼中的代谢和消除规律，确定休药期。主要研究内容：

1）高低两种剂量 TAP 单次口服后在鲈鱼血液中的药时曲线；

2）高低两种剂量 TAP 连续 5 次口服后在鲈鱼血液和肌肉+皮中的消除规律。

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.1.1 实验动物

健康鲈鱼（Lateolabras janopicus），平均体重（250±6）g，饲养于实验中心，试验用水为海水，盐度为3.5%，水温（22±3）℃，充气，流水，每日投喂空白混合饲料，用前暂养两周，检验表明试验用于血液和组织无甲砜霉素及其它药物残留。定期检查试验与状态，如果有发病者，剔除并查明原因，选择健康者进行实验。

6.2.1.2 药品及试剂

甲砜霉素(TAP)标准品 购于sigma公司，纯度99.99%；甲砜霉素(TAP)原粉购于浙江海翔药业有限公司，纯度99.9%；甲醇 、乙腈 色谱纯；乙酸乙酯 化学纯；正己烷 分析纯；双蒸水 实验室自行制备。

6.2.1.3 实验仪器

高效液相色谱仪 Waters2695 美国Waters公司

匀浆机 XHF-1 上海仅达生化仪器厂

台式离心机 TGL-16C型 上海安亭科学仪器厂

电子天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

超声波振荡仪 SB5200型 上海必能超声有限公司

旋转蒸发仪 RF-52型 上海亚荣生化仪器厂

3） 色谱条件

色谱柱：XTerra? MS C18 5μm， 4.6 × 250mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L 醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 1 mL/min；柱温 30℃；进样量 20μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为：224nm。

4 ）回收率（recovery）测定

空白组织中加入浓度为0.05、0.5、5、20μg/mL的TAP标准液，放置2小时，使药物充分渗入组织，按样品处理方法处理后测定，所得峰面积平均值与上述标准液直接进样测得的峰面积平均值之比值，即为药物的提取回收率。

5）精密度（precision）

将上述TAP的四个浓度样品与一天内分别重复进样5次和分5天测定，计算四个浓度水平响应值峰面积的变异系数（C.V%）和平均变异系数（C.V %），以此衡量定量方法的精密度。

6） 检测限（Limit of detection ，LOD）

取空白样品，按样品处理程序处理后测定，另外将空白组织制成低浓度的药物含量的含药组织，预处理后测定，对比二者，将引起2～3倍基线噪音的药物浓度定义为最低检测限。

7 ）标准曲线与线性范围（linear range）

取空白组织，加入标准溶液配制的梯度标准液，静置一段时间后，按样品处理方法处理后进样，每个人浓度水平重复三次，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标作标准曲线，并求出回归方程和相关系数。以此估计样本中的TAP的线性范围。

6.3 结果与讨论

6.3.1 TAP 的色谱行为

进行药物动力学及残留研究当前多采用高效液相色谱法进行样品分析。由于生物样本的特殊性，对其中的药物分析对分离提取条件有特殊要求。液相色谱分析中，大多数样品的基质及成份组成相当复杂，大量性质未知的组分以无法预料的方式影响分析过程，尤其在残留分析中待测物质仅痕量存在，有时待测组分不确定。因此生物样品在分析前先要对样品进行预处理，以排除干扰，增加检测的灵敏度和选择性，使其符合所选分析方法的要求。在本实验建立的色谱条件下，样品进行HPLC分析，基线走动平稳，药物峰与杂质峰分离良好。

6.3.2 TAP 回收率

回收率是反映从制备样品到测定等各环节误差大小及间接反映测定准确度的一个指标。各组织中药物回收率见表6-1。由表中可以看出，各组织中TAP高低浓度回收率都比较高，达到85%以上，而且比较稳定。表明实验方法可行。

表6-1 组织中TAP的回收率

Tab.6-1 Recovery rate of TAP in tissues

样本浓度（μg/mL） 回收率（n=5）X ±SD

肌肉+皮 血液

0.05 90.32±2.63 85.69±1.78

0.5 92.53±2.18 87.53±2.12

5 93.24±1.95 88.65±1.85

10 90.16±2.14 89.16±1.92

平均回收率% 91.56±2.23 87.75±1.92

6.3.3 精密度

组织中 TAP 四个浓度（0.05、0.5、5、20μg/mL）的日内及日间变异系数（C.V%）及总平均变异系数（C.V %）见表 6-2。该指标可反映生物样品从制样、保存到检测各环节的总误差，是评价测定方法准确度的标准之一。要表中可以看出，血液及组织中药物的测定结果较稳定，说明本实验方法可靠。

表 6-2 组织中 TAP 进行 HPLC 分析的变异系数

Tab. 6-2Precision of TAP in tissues by HPLC

组织样品 药物浓度（μg/mL） 日内变异系数（C.V%） 日间变异系数（C.V%）

0.05 2.86 3.59

0.5 2.14 3.13

5 1.83 2.54

10 1.17 1.95

肌肉+皮C.V % 2.00±0.86 2.80±0.85

0.05 3.63 4.82

0.5 3.01 3.83

5 2.26 3.01

血液

10 1.82 2.34

C.V % 2.68±0.95 3.50±1.32

6.3.4 标准曲线及线性范围

按照标准曲线的做法，以相应浓度 Ci 对测得的各平均峰面积作线性回归，制作标准曲线，TAP 在组织的标准曲线回归方程及相关系数见表 6-3。标准曲线见图 6-1，6-2。

线性范围 0.015～30μg/mL（n=5）。由相关系数知，在标准曲线的线性范围内，HPLC测定线性良好，此标准曲线可用于准确定量。

表 6-3 组织中 TAP 的标准曲线方程及相关系数

Tab.6-3 Standard curve equations and coefficients of TAP in tissues

样本 标准曲线回归方程 相关系数

肌肉+皮 Y=3639.2X－2356.1 0.9997

血液 Y=3099.6X－1986.4 0.9991

y = 3099.6x - 1986.4

R2 = 0.999

0

20000

40000

60000

80000

100000

0 5 10 15 20 25 30 35

浓度（μg/mL）

面峰积图 6-1 TAP 在肌肉+皮中的标准曲线

Fig.6-1 Standard curve of TAP in muscle

y = 3639.2x - 2356.1

R2 = 0.9997

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 5 10 15 20 25 30 35

浓度（μg/mL）

面峰积图 6-2 TAP 在血液中的标准曲线

Fig.6-2 Standard curve of TAP in plasma江

6.3.5 最低检测线

在本实验条件下，组织中 TAP 最低检测限为 0.01μg/mL。6.3.6 鲈鱼单次口服 TAP 后体内组织中药物浓度鲈鱼单次口服 15 和 30mg/mLTAP 后，不同采样时间血液中药物浓度见表 6-4；表 6-4 鲈鱼单次口服 15 和 30m g/kg TAP 后在组织中药物浓度（ X ±SD）

Tab.6-4 Tissue levels(mean±s.d.)of TAP in Lateolabras j anopicus after single oral administration at

a dose of 15and 30m g/kg

时间（小时） 血液中 TAP 浓度（μg/mL）

15mg/kg 30mg/kg

1 0.59±0.32 0.88 ±0.28

2 1.82±1.13 3.64±1.98

3 4.19±2.15 5.37±0.91

4 4.46±1.36 5.10±0.45

6 6.31±0.91 6.03±0.63

8 5.19±0.49 10.21±0.86

12 5.55±0.26 7.01±0.76

24 0.71±0.16 0.78±0.16

36 0.66±0.08 0.66±0.1

TAP 在鲈鱼血液内的药物浓度-时间曲线图见图 6-3

AP在T液血的中度浓Lμg/m（） 15mg/kg 30mg/kg

图 6-3 鲈鱼单次口服 15 和 30mg/kgTAP 的药-时曲线Fig.6-3 The concentration-time curve of TAP in Lateolabras j anopicus aftersingle oral administration at a dose of 15 and 30m g/kg

表 6-5 鲈鱼单次口服 15 和 35mg/kg TAP 的药代动力学参数Tab.6-5 Pharmacokinetic parameters of TAP after single oral administration at a dose of 15 and

30m g/kg in Lateolabras j anopicus

参数 血液

15mg/kg 30mg/kg

Cmax (μg/mL) 6.31 10.21

Tmax (h) 6 8

AUC0 36 (μg·h/mL) 58.0 102

MRT0 36 (h) 11.9 11.1

Cmax:单剂量给药在血液中出现的高峰；Tmax：单剂量给药在血液中出现的高峰的时间；AUC0 36：药物浓度-时间曲线下的面积。MRT0 36：平均滞留时间。

峰浓度 Cmax 和达峰时间 Tmax 等是衡量药物在体内吸收速度和程度的重要参数。由药时曲线可以看出，鲈鱼口服高剂量和低剂量的 TAP 药物后，吸收比较缓慢。服用高剂量的 TAP 以后，在血液中的达峰时间为 8 小时，明显低于低剂量的达峰时间 6 小时。这可能是提高剂量后。对药物的吸收有轻微的延缓作用。在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限量[1]（50ng/mL）。数据表明，单次口服药物后 2～3 天的鲈鱼不能作为人消费的食物。当用峰浓度 Cmax 和药物浓度-时间曲线下的面积AUC0 36 与所服药物的剂量 D 相除即：Cmax/D ，AUC0 36 /D 时，其结果分别为：高剂量为 0.42 μg/mL ，3.87μg·h/mL；低剂量时为：0.34 μg/mL ，3.4μg·h/mL。从结果可以看出，当服用高剂量和低剂量药物时，二者的结果很相似。这表明药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数是个常数。MRT0 36平均滞留时间的数值高剂量时为 11.1 小时，低剂量时为 11.9 小时，从而表明药物的消除速率不依靠药物剂量的服用的大小。

甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程：C=10.812（e-0.087t–e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 2.529h，消除半衰期为 7.966h。

Mazzolini 等[2]在 997 年的研究中发现，药物 TAP 对鱼类中两种很重要的病原体Vibrioanguillarum 和 Photobacteria damsela var.piscicida 的最小抑制浓度（MIC50 ）分别为 2.5μg/mL 和 5 μg/mL 。本实验中，单次口服高剂量的 TAP 药物，它在体内血液中的浓度能超过 5 μg/mL 的时间间隔为 12 小时，服用低剂量的 TAP 药物，它在体内血液中的浓度能超过 2.5 μg/mL 的时间间隔为 12 小时。这个浓度足够抑制病原体的发作。

6.3.7 TAP 在鲈鱼体内的消除规律

表 6-5 鲈鱼连续口服 15 和 30 mg/kg TAP，第 5 次给药后的组织药物浓度（ X ±SD）Tab.6-5 Concentrations (mean±s.d.)of TAP in L ateolabras j anopicus after the fifth of oraladministration of 15 and 30 m g/kg for five consecutive days

时间（d）

血液中 TAP 的浓度（μg/mL）

肌肉+皮中 TAP 的浓度（μg/g）

15m g/kg 30m g/kg 15m g/kg 30m g/kg

0.125 0.74±0.07 1.34±0.35 0.93±0.16 1.48±0.23

1 0.67±0.05 0.75±0.29 0.62±0.15 1.21±0.19

2 0.23±0.02 0.35±0.21 0.09±0.05 1.05±0.10

4 0.08±0.01 0.12±0.02 0.03±0.01 0.06±0.01

6 ND ND ND ND

8 ND ND ND ND

10 ND ND ND ND

ND：低于检测线