tcxuefeng
第41楼2012/06/28
1,1-adequate
较2D-inadequate而言,1,1-adequate通过间接检测灵敏度更高的H核而使CC关系这一"不可能的任务"(inadequate)得以实现(adequate)。不过与inadequate不同,这一实验的局限在于只能给出CH-C这类结构的信号。
这一实验之所以会称为1,1-adequate,是因为所给出的信号是由J1HC传递到J1CC。为了克服之前所提到的局限性,不满足的核磁学家们开发出了一些传递更远的adequate,这个系列又称为n,n-adequate,以后有机会我会做这些谱放上来。
好在日常结构中三个季碳相邻的情况并不是很多,因此我们仍然能够借助于这一神奇的实验寻找CC连接的碎片来补全C骨架连接顺序的拼图。
由于这一实验的C维是双量子信号,因此纵向F1维的坐标并不能和C谱对应,而是相关CC化学位移的总和!下面我将着重介绍这一特殊谱图的解谱方法。
图中83 ppm处的轴峰(C的中心频率)是一种典型的系统干扰信号,因此我用红线划去。而不知道为什么,实验的F1维坐标是错的,为了和实际情况对应,这里我保留谱图的原貌,而在上图的括号中给出这个点应该在的坐标位置,大家可以通过计算实际点与谱图点之间的差值看到,这一坐标平移是遵循原谱各点化学位移的。F2维与对应的氢谱坐标一致。
上面给出了结构中各碳的化学位移值,以H10为例,在J1CH传递后H10分别与C11与C3存在J1CC关系。谱图中可以看到,H10在纵向F1维有两个相关点。而碳谱中相应化学位移如下:C10=29.6 ppm ; C11=42.7 ppm C3=112.4 ppm,稍加计算我们可以得到C10+C3=142.0 ppm ; C10+C11=72.3 ppm,这与两个相关点F1维坐标接近一致!不妨再计算下H9的关系,我们知道C9=100.3 ppm ; C4=127.8 ppm ; C8=153.0 ppm,那么根据结构上给出的连接关系,C9+C4=228.1 ppm ; C9+C8=253.3 ppm,这同样与H9在F1维的两个相关点坐标相同。限于时间关系,我不一一计算,大家感兴趣可以根据上面的方法自行推导——最终,我们得到如图结构中红线给出的连接关系,CC相关得到了归属!
需要注意的是,C6与C7相关没有在图中显现,这可能与我实验参数的选取有关,也可能是这一信号信噪比太弱导致,这也表明这类实验解谱需要像HMBC一样灵活应对,而不能过于死板。
总体而言,1,1-adequate在解决C-C信号灵敏度过低上有了很大的突破,但实际解谱中较为繁琐,F1维坐标不够直观。在和布鲁克工程师交流后,她向我推荐了另外一种更方便的实验,随后我将给出。
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第42楼2012/06/28
J-HMBC
一种被称为J-HMBC的实验能够给出CH多键耦合常数的信息,这一实验在判定结构(如顺反异构的C-H耦合值差别较大)及优化HMBC参数方面有着重要的作用。
J-HMBC的谱图与HMBC有相似的地方,但不同在于HMBC上的CH相关点沿碳维裂分成了两个,两点间的距离除以放大因子(SCALEF)即为CH远程耦合常数。
以H7为例,局部图中H7与C5的相关点被裂分成了相距426 HZ的两个峰,本实验的SCALEF为43,426/43=9.9 HZ即为J3H7C5的值,同样的方法,我们可以算出J2H7C8约为2.4 HZ,这就很好地解释了在HMBC中H7与C5相关点比其与C6的相关点更强的事实。以此类推,再结合HMBC的CH一键耦合数据,在C13CPD中缺失的CH耦合关系便完美地呈现在了解谱人员的眼前。
需要注意的是,J-HMBC中同样有漏过的CH一键相关信号。图中圆圈标示的6055HZ除以43即为C14与H14的耦合常数141 HZ。这一点在解谱中需要予以区分。
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第46楼2012/07/02
NOESY
NOESY上相关信号描述的是化合物H之间空间距离的远近关系,与COSY,TOCSY等依赖化学键传递不同,不同H之间即使相隔多键,只要他们空间上相互接近(如下图),就可以在NOESY谱图上找到相关点。
图中的NOE是Nuclear Overhauser Effect的缩写,之前在讨论C13CPD中曾经出现过,是指当照射H核时邻近C核的谱峰也相应增强,而在同核中这一效应同样存在:当照射H核时,与其空间上小于4A(埃)的H信号会获得轻微的增强(不超过20%)并被检测到,该效应强烈依赖空间距离(与距离的6次方成反比)。凭借这一特殊性质,NOESY实验成为了化学家,生物学家们研究分子空间结构以及生物大分子结构与功能关系的强大工具。
但NOESY要做成功并不容易。NOE效应与分子本身有关,一般在NOESY谱图中将对角峰调为正吸收,此时NOE信号在谱图上的正负取决于一个与分子运动状况相关的参数(慢运动条件下为正峰,快运动条件下为负峰),但尴尬的是当这一运动正好处在一个不快不慢的状态时,即使相隔很近的H之间也无法观察到NOE效应。由于分子运动状况常和分子大小相关,因此NOESY更适合于大分子和小分子,而我们最常遇到的中等分子信号增强往往很弱。不过,之后提到的ROESY实验可以克服这方面的问题。
在日常应用中,NOESY的实验参数优化就是混合时间的优化。上图中横坐标为混合时间,虚线为不同混合时间对应下交叉峰的强弱,可以看到对于不同大小的分子,存在一个最优的混合时间使交叉峰最强(一般分子量大的最优混合时间短)。通常,这个时间接近于分子各峰平均的纵向弛豫时间T1,针对我们的化合物,我通过零点法优化混合时间如下
d8是反转恢复后的等待时间。比较而言,在0.7秒时大部分峰接近于零点,零点法公式可以估算出1.0秒为系统的平均T1,这也是我优化后的混合时间(具体做法可以参考本版【分享】NOESY实验的参数优化一贴)。
上图是在系统默认0.3秒混合时间以及优化后的1.0秒下所做谱图的对比。在将对角峰调到相近强度时可以看到优化后的谱图(右)交叉峰明显更强。
回到一开始给出的NOESY谱图。实际上这一化合物的NOESY并不典型:由于样品浓度很高以及DMSO对于氢键的稳定作用,使得分子内以及分子间围绕着结构中的N和O在氢键作用下形成了各种不同的空间构象。需要强调的是,与依赖键传递的二维谱不同,NOE信号可以在不同分子间传递!因此,当抬高阈值时,我们看到了太多的NOESY信号(下图)
大家可以试着围绕N,O画出两个分子间可能形成的各种氢键连接便能理解这一画面出现的原因了。不过还是可以看到,最强的NOE信号出现在H6-H7,H9-14以及H9-H10之间,这暗示着分子内氢键在整个体系中占了最大的比例。
最后要提的一点是,由于脉冲序列相似,NOESY中经常夹杂着COSY信号,这点需要在解谱时予以区分(好在键相近的核空间距离往往接近)。而另外一种用来检测分子内化学交换的谱图(EXSY)和NOESY用的是同一个脉冲序列。
tcxuefeng
第48楼2012/07/02
1D-选择性NOESY
由于NOE信号增强很弱,因此NOESY常常需要扫描很长的时间(数小时到数天不等)。而通常情况是,实验人员并不需要得到整个结构的NOE关系,往往几个关键H之间的距离远近就足以对化合物结构做出一个准确的判断。在这种情况下,1D-选择性NOESY可以通过有目的地照射目标峰来快速得到需要的信息。
为了保持一致,这一实验的混合时间仍然定在1.0 s,选择性脉冲照射在了甲基的H上。在相同的扫描次数下,1D仅需要2D实验1/256的时间,却在H14上得到了和二维实验相同的结果。如果化合物浓度很低,那么节省下来的时间又可以成倍地用在增加扫描次数来提高信噪比上。事实上,在实际应用中,我更倾向于使用NOESY实验的1D版本。
需要注意的是,正负信号都有可能在空间上 与照射峰接近,具体原因参见NOESY中正负峰的分析。
tcxuefeng
第49楼2012/07/03
ROESY
与NOESY一样,ROESY给出的是结构中H核之间的空间关系,但与NOESY纵向交叉弛豫不同,ROESY通过自旋锁定使交叉弛豫发生在锁定方向上,从而带来如下两个方面的优点。
上图截取自
实践中采用哪种谱图,一般视具体情况而定。通常,大分子或小分子常用NOESY,而中等大小分子ROESY比较合适。本例中与NOESY对比,ROESY信号显得更弱一些。
需要注意的是,由于与TOCSY采用相似的脉冲序列(仅自旋锁定时间不同),在ROESY解谱时要注意排除TOCSY信号的干扰。