核心参数
规格 | 50 test、20 test |
产品介绍
在包装重组病毒的过程中,质粒转染是影响病毒包装效果的重要一步。本试剂盒是基于CaPO4法开发的病毒包装试剂盒,在293T细胞中有非常好的转染效果。
CaPO4法最初是作为检测病毒DNA传染性的一种技术而发展起来的,由CaPO4形成的沉淀通过增强DNA对细胞膜的吸附作用,促进哺乳动物细胞对DNA的摄取,从而达到转染的目的。CaPO4沉淀还限制了哺乳动物细胞内DNA酶对DNA的消化。
本试剂盒包含能够快速、简便、高效地对293T细胞进行质粒转染的必要试剂,可同时用于慢病毒和逆转录病毒的包装,可在100mm培养皿中进行20-50次转染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO4沉淀;Solution3为本公司生产并经严格筛选的胎牛血清,用于病毒包装过程中添加到细胞培养基中;Solution 4为病毒包装增强试剂,可有效提过病毒包装效率;Solution 5为病毒感染增强试剂,用于靶细胞感染;Controlplasmid为EGFP慢病毒质粒,用于包装阳性对照病毒。
产品特点
►操作简单、快速、高效
产品成分
试剂名称 | 内容 | 规格 | 储存 条件 | |
-20T | -50T | |||
Solution 1 | 2.5M CaCl2 | 2ml | 5ml | -20℃ |
Solution 2 | 2×BBS | 10ml | 25ml | |
Solution 3 | Modified Fetal bovine serum | 10ml | 25ml | |
Solution 4 | Packaging Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Solution 5 | Infection Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Controlplasmid | CMV-EGFP | 40μg | 100μl | |
UltrapureH2O | H2O | 10ml | 25ml | 4℃ |
注:Solution 1、Solution 2应避免反复冻融,请根据实验情况分装使用。
其他所需材料
超纯水
293T (Acme-293T,东岭生物)
DMEM高糖培养基
Fetal bovine serum (FBSV500,东岭生物)
磷酸盐缓冲液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, Adjust the pH to 7.4 with HCl)
操作流程
病毒包装
1.提前一天消化293T细胞,重悬于37℃预热的DMEM完全培养基中(10%FBS,无抗生素,以下简称为D10),计数;
2.每个培养皿接种4.5×10^6细胞,10mlD10,轻轻晃动,将细胞完全混匀;
3.在含5%CO2培养箱中37℃培养过夜(转染前细胞密度应达到60%-70%,可根据细胞生长速度对细胞接种量作调整);
4.转染前3h配制含有2.5% Solution 3的DMEM培养基(以下简称为D2.5,不含双抗),37℃预热备用;
5.转染前2h吸去培养皿中培养基,每皿更换7ml上一步预热的D2.5,放入培养箱中备用,注意避免细胞脱落;
6.准备涡旋仪,70%酒精擦拭消毒后置于无菌操作台备用;
7.根据下表准备DNA混合液(该体系以慢病毒包装载体pMD2G和psPAX为例,为1个100mm培养皿用量):
试剂 | 用量 |
pMD2G | 6μg |
PSPAX | 15μg |
慢病毒表达载体 | 20μg |
H2O | Add H2O to 450μl |
8.边涡旋边逐滴加入50μl Solution 1,以充分混匀;
注:以上所用试剂均需恢复至室温,阳性对照组用CMV-EGFP代替慢病毒表达载体。
9.在15ml离心管中准备等体积500μl Solution 2,在涡旋仪上快速涡旋,同时逐滴加入配制好的DNA混合液(该过程必须逐滴加入);滴加结束后再涡旋5-10s;
注:因Solution 2 pH对温度非常敏感,必须恢复至室温后使用。
10.将混合液室温孵育20min;
11.同时,在待转染细胞培养皿中加入8μl Solution 4,混匀后放于培养箱备用;
12.孵育结束后用移液枪或移液管轻轻混匀混合液,此时可见混合液略有浑浊;
注:混匀一定要轻柔,可通过吹泡泡(bubble mix)的方式混匀。
13.将混合液逐滴均匀滴加至培养皿中,前后左右轻轻晃动培养皿,充分混匀;
14.将培养皿放于含3%CO2培养箱中培养;
15.12-16h之后(不超过16h),37℃预热DMEM无血清培养基(可用PBS代替)和D2.5;
16.吸去培养皿中培养基,用预热的DMEM无血清培养基轻轻洗2次,10ml/次,之后加入10ml上步预热的D2.5,混匀后置于含5%CO2培养箱中37℃培养;
17.转染36-48h后收集培养上清,2200rpm,4℃离心10min去除细胞碎片,置于4℃冰箱短期保存(不超过2天),或分装后于-80℃长期保存。
注:冻存的病毒应在冰上或4℃解冻,且避免反复冻融。
18.收集的病毒上清可直接用于滴度测定,或浓缩后分装保存;
本公司同时提供病毒浓缩试剂(货号:GE-19002-50),可方便快捷高效地浓缩病毒,不需要超速离心机。
供应商
银牌会员 第2年