淋巴细胞的分离和激化实验

一、实验试剂 1. PBS（Dulbecco）： 0.10 g/L 无水CaCl2 0.20 g/L KCl 0.20 g/L KHPO4 0.10 g/L MgCl2.6H2O 8.00 g/L NaCl 2.16 g/L NaH2PO4.7H2O 调pH至7.4 2. 生长培养基： 不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基 10% FBS 庆大霉素（可不用）（10 μg/ml） 2 mmol/L L-谷氨酰胺 1 mmol/L 丙酮酸钠 3. 促细胞分裂剂（终浓度） 5 μg/ml PHA：1 mg/ml母液-20℃分装冻存 25 μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4 mg/ml母液-20℃分装冻存 商陆促分裂原：再水华母液-20℃分装冻存 二、实验步骤 1. 收集10 ml全血，加入不含防腐剂的肝素（0.2 ml肝素/10 ml全血）。实验全过程保持无菌操作。 2. 在15 ml离心管中的肝素化血中加入1 ml 6%葡萄糖，室温放置20~30 min，沉降红细胞。沉降时间不宜过长，否则单核细胞将不再保留在富含白细胞的血浆。 3. 从葡聚糖处理的血中小心收集红细胞上层的富含白细胞的血浆。 4. 富含白细胞的血浆室温300 g离心8 min，沉淀细胞。 5. 弃上清，细胞轻悬于1 ml PBS中。 6. 于室温下，用无菌巴斯德吸管小心将细胞悬液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技术熟练，才能保持血浆曾在Ficoll-Hypaque层之间界面清晰。 7. 400 g低温（4℃）离心30 min，沉淀细胞。离心后切记不要破坏管中的分层。 8. 淋巴细胞在血浆和Ficoll-Hypaque层之间的白色浑浊条带中，小心取出贮存，弃红细胞沉淀。 9. 5 ml PBS洗一次细胞，室温250 g离心5 min，沉淀细胞悬于3~5 ml生长培养基中。 10. 全部细胞悬液转移至T25组织培养瓶，加促细胞分裂剂。