代谢组学中离子/极性化合物分析的正确打开方式 ——IC-HR/AM MS系统应对代谢组学的挑战

  离子色谱技术（Ion Chromatography, IC）作为进行离子型化合物分析的重要手段，被广泛应用在食品、环境、 制药、化工、科研等领域。Thermo Fisher Scientific在离子分析领域已有40多年的研究历史，开创了现代离子色谱时代，帮助建立了众多标准方法，惠及全世界范围的科研工作者。应用在组学领域时，完整的惰性材料流路充分具备了系统的抗生物污染和金属污染条件，可完成糖类、氨基酸、核酸、蛋白质和多肽的分离测定。

  本篇应用将从技术方案出发，为你介绍离子色谱技术及串联Orbitrap高分辨质谱应用于代谢组学研究的优势，应对代谢组学研究中离子型和极性代谢物分析的挑战。

1 代谢组学的挑战：

1.1 提高代谢物谱的检测范围

  代谢组学的研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质，包括代谢物的前体、衍生物和具有一定浓度的降解产物，它们都极具多样性且变化迅速。如何提高代谢物谱的检测范围一直是代谢组学研究中挑战之一。研究者往往需要采用一些互补的检测技术，如液质联用（LC-MS）中的HILIC、RPLC，气质联用（GC-MS）以及核磁共振（NMR）技术，来覆盖不同化学性质的代谢物。

1.2 极性代谢物/离子化合物分析

  作为代谢组学领域重要的研究对象，糖酵解途径代谢产物、三羧酸循环代谢产物以及核酸化合物，因其重要的生物学功能，研究越来越受到重视。以往这类化合物的检测，研究者多采用GC-MS技术，但由于这些代谢物的极性强、挥发性低，往往需要进行衍生化处理，大大增加研究者的工作量和数据挖掘过程中的不确定性。离子色谱作为液相色谱的一种，对糖类、氨基酸、核酸、有机酸等物质的分析起着重要的作用。

1.3 同位素干扰

  在代谢组学最前沿的技术——代谢流分析中，采用“同位素示踪”实验来追踪标记的重同位素在代谢网络中的流向，通过测定代谢网络中的代谢物被同位素标记的情况，从而可以更好的揭示代谢物的产生、流向，帮助代谢通路研究更清晰、更准确，逐渐成为代谢组学研究中的热点技术。但在实际应用中，却存在一定的技术瓶颈，当标记的重同位素和基质中的质谱峰发生重叠时，容易出现假阳性的测定结果，同时影响定量的准确性。

2. 应用解决方案

  Thermo Scientific 在离子分析领域已有40多年的研究历史。40多年来，赛默飞世尔科技始终作为离子色谱的领导者，引领着整个离子色谱市场的发展方向。Thermo Scientific™ Integrion 系统和Thermo Scientific™ ICS-5000+高压离子色谱系统，是赛默飞最新推出的高端研究级多功能离子色谱系统。通过其专利的离子色谱抑制器技术，可与质谱直接相串联，最大程度提高痕量组分检测的灵敏度，以及对共流出组分的确证能力。

Thermo Scientific™ Integrion高压离子色谱系统：

• 全世界耐压最高的离子色谱泵，耐压高达6000 psi；

• HPIC 淋洗液自动生成

• 全面兼容4μm 小粒径色谱柱，分析速度更快；

• 极大提升了峰容量，进一步优化了分离能力。

 Thermo Scientific™ ICS-5000+高压离子色谱：

• 世界上首款毛细管高压、“只加水”离子色谱系统；

• 单系统和双系统的灵活性配置，支持多种检测器；

• 兼容毛细管、微孔和标准体系，色谱分析更加灵活；

• 出色的耐压性能，支持小粒径色谱柱分离，大大提高了分辨率；

• 绿色理念离子色谱：毛细管色谱模式下，淋洗液发生器可以连续使用18个月，一年仅消耗5.25L 水，极大降低了试剂的消耗；

2.1 离子色谱抑制器技术——离子色谱联用质谱成为可能

  在离子色谱流动系统中，待分析物以及淋洗液中的可离解物质均以离子状态存在，而质谱仪的接口对酸、碱、金属盐的耐受度较低，一直制约着离子色谱与质谱联用技术的发展。离子色谱的抑制器组件将淋洗液中的反离子除去（如阴离子分析中，除去阳离子）。将淋洗液近乎转变为水溶液，从根本上解决了离子色谱与质谱联用的接口技术难题。

2.2 在线电解淋洗液发生器技术

  赛默飞世尔科技提供免化学试剂的在线电解淋洗液发生器技术，免化学试剂（RFIC）为赛默飞的专利技术，多次荣获国际大奖（2002年匹兹堡银奖、2003年匹兹堡金奖、2005年匹兹堡银奖）。

  在线电解淋洗液发生器是RFIC离子色谱系统的心脏。通过电解水在线得到高纯度的淋洗液，实现线性梯度。相比传统方法，不再需要购买价格昂贵的梯度泵，也不需要手工配制浓淋洗液，完全避免了容器和试剂污染引起的基线背景升高。是离子色谱发展的重要里程碑。

3. 应用解决优势

3.1 优异的分离能力

  Junhua Wang 等采用Thermo Scientific™ ICS HPIC串联Q Exactive（Cap IC/Q Exactive）系统对头颈部肿瘤代谢组学进行研究，Cap IC/Q Exactive系统显示出出色的分离能力，与现有的检测技术相比可以得到更全面的结果。以m/z=259.0224提取离子流图为例，采用Cap IC/Q Exactive系统系统得到的结果中，可提取11个色谱峰（图a）。相同条件下UHPLC（图b）和HILIC（图d） 模式的分离效果可满足要求，但只有3个色谱峰。也就是说，采用常规检测方法，将损失2/3的同分异构体化合物。代谢物结构上的改变往往带来生物学功能发生很大的变化，越来越多代谢物的发现和检测，有利于深入揭示细胞或生物体的代谢过程和代谢调节机制。

3.2 出色的灵敏度

  采用Thermo Scientific™ ICS HPIC串联Q Exactive系统对21个标准品混标的检测结果显示，灵敏度相比HILIC和UHPLC模式提升约100倍。Cap IC/Q Exactive系统采用的色谱柱柱内径为0.4 mm，大大降低了离子在柱内的扩散效应，极大增加了质量灵敏度，检出限可低至pg/ml。

3.3优异的重现性

  Junhua Wang 等采用Cap IC 、HILIC、UHPLC三种模式串联Q Exactive系统，连续6天对49个代谢物进行检测分析。结果显示三个无机离子Cl^-，CO3^2-及PO4^3-的响应强度的RSD%分别为5.5%,7.8%和6.0%，保留时间的RSD%分别为6.5%,8.0%和7.2%。代谢组学是一种寻找差异的科学研究，结果的准确性依赖于分析仪器的重现性。ICS HPIC系统经过精心打造，使用RFIC-EG装置，避免了人为误差的引入，可极大的改善系统方法重现性结果。

3.4 orbitrap质量分析器消除同位素干扰

  通过检测¹⁵N标记的谷氨酰胺（Glutamine，C₅H₁₀¹⁵N₂O₃）来追踪生物胺在代谢通路中的流向研究中，谷氨酰胺和谷氨酸盐（Glutamate，C₅H₉NO₄）在反相色谱中存在共流出的情况，当仪器的分辨率满足不了要求时（如传统Q-TOF检测器,R=20,000），¹⁵N标记的Glutamine和Glutamate质谱峰发生重叠，容易出现假阳性的测定结果，同时影响定量的准确性。Orbitrap 技术是实现超高分辨率质谱分析的公认标准，使用Orbitrap质量分析器，把仪器的分辨率提高到R=100,000时，¹⁵N标记的Glutamine和Glutamate质谱峰信号达到基线分离，解决“同位素示踪”实验过程中的瓶颈。

总结

  赛默飞离子色谱技术在离子色谱行业一直处于领先地位，引领着整个离子色谱市场的发展方向。因其特殊的分离机理，在代谢组学研究中发挥着重要的作用。高分辨orbitrap质谱因其优异的定性定量能力，结合了高分离能力的离子色谱和高选择性的质谱优势的ic-hram分析方法，可以简单的色谱条件应对各类复杂基质挑战，是代谢组学样品，特别是离子型和极性代谢物检测的理想选择。

参考文献：

1. Wang J, Christison TT, Misuno K, et al. Metabolomic profiling of anionic metabolites in head and neck cancer cells by capillary ion chromatography with Orbitrap mass spectrometry. Anal Chem. 2014 May 20;86(10):5116-24.

doi: 10.1021/ac500951v. Epub 2014 May 9.

2. Hu S, Wang J, Ji EH, et al. Targeted Metabolomic Analysis of Head and Neck Cancer Cells Using High Performance Ion Chromatography Coupled with a Q Exactive HF Mass Spectrometer. Anal Chem. 2015 Jun 16;87(12):6371-9

doi: 10.1021/acs.analchem.5b01350. Epub 2015 May 22.

3. Jan C van Dam, Michael R Eman, Johannes Frank, et al. Analysis of glycolytic intermediates in saccharomyces cerevisiae using anion exchange chromatography and electrospray ionization with tandem mass spectrometric detection. Analytica Chimica Acta. 460 (2002) 209–218

doi.org/10.1016/s0003-2670(02)00240-4