并联2D NanoLC技术－更好更快地分离蛋白质组的技术

生命科学的发展速度往往受到生命分析化学水平的制约，在后基因时 代，人们面临的是比基因研究更为复杂的蛋白质组的研究，人类基因组有3－ 4万个基因，而表达的蛋白质可能达到十几万或几十万，如何在如此复杂的基 质中高灵敏度、高选择性、高通量和高准确性地分析待测组分，是生命分析 化学需要解决的重要问题。 由于蛋白样品量稀少珍贵，要求分析柱具有高灵敏度和高容量，同时质 谱的在线联用要求尽可能少样品量，因此希望有在极复杂基质中“高灵敏 度、高选择性、高通量和高准确性地”分析待测组分的方法和仪器，毛细管/ Nano级的液相色谱就应运而生了，为了获得更好的分离效果，又发展了2D Na noLC 技术。 戴安公司/LC PARKING典型的UltiMate Nano LC系统2D分离的流程： 样 品用FAMOS微量自动进样器吸取样品后，加样泵注入到BioX-SCX 强阳离子交 换柱上(at 30 µl/min) ，再次使用FAMOS，分别用不同浓度的盐从 BioX-SCX 强阳离子交换柱 向RP捕获柱重复淋洗肽的碎片，当捕集到肽后，系统开始除 盐，NanoLC梯度(200 nl/min) 开始从捕获柱反冲肽片段进入NanoLC的分析 柱，肽在这里被分离且结果非常容易辨认，通过改变盐的浓度，还可降低识 别的复杂性。尽管以上的工作是全自动进行，大大改进了峰的识别，但仍有 弱点，由于向阳离子交换柱上注入的是一段一段的不同浓度的盐（我们暂时 称它为盐栓），使分离能力受到限制，色谱的分辨率不高，同时有很多高丰 度肽被共洗脱和重复地检测，而产生大量的不必要的质谱数据。另外高丰量 肽的拖尾影响了低丰量肽的识别，从而降低了峰容量，为克服这些弱点，戴 安/LC PACKING又发展了2D双梯度的并联技术。 双梯度的并联技术，使用两个独立的梯度泵，用连续不断的线性盐梯度 取代盐栓，我们称它为并联毛细管/NanoLC，它的特点是增加了对蛋白的识别 能力，同时可以大大增加MS的通量。 图中的例子中，我们用的是毛细管泵做一维分离，Nano泵做二维分离， 两个泵均通过毛细管/Nano流速传感器实时监控流速。第一个梯度泵做盐梯度 淋洗，两个反相捕获柱交替工作以增加通量，第二个泵将两个捕获柱中的片 段交替地反冲入75微米分析柱 。后面左图是用0－100mM KCl 分7个浓度淋洗 SCX柱再经反相分离后得到的总离子图，大部分离子在中性淋洗和5－10mM KC l期间被淋洗出来，右图是500mM KCl 从0－30％线性梯度，可以看到有更多 的肽片段在不同的阶段被淋洗出来，对选中的峰做质谱分析的结果：不同浓 度盐栓洗脱可识别53个蛋白，而线性梯度的结果可识别98个，特别是低丰度 的蛋白，并联2DNanoLC大大增加了对蛋白的识别能力。 （注：戴安公司将于11月25日在北京首都大酒店举办上述技术的技术交 流会，将由戴安荷兰公司的国际销售经理做技术报告，有意参加者请登陆我 们的中文网站www.dionex.com.cn下载会议邀请函，或直接与我们联系索要， 联系电话：010 64434148 常先生）