快速深度单克隆抗体 De novo 测序

2018/01/29   下载量： 19 次

方案摘要

方案下载
应用领域 生物产业
检测样本 其他
检测项目
参考标准 氨基酸序列信息

通过 Trypsin，LysC，Chymotrypsin，GluC 和 AspN 5 种酶进行多酶酶切，采用 HCD 和 ETD 两种互补碎裂方式，以及后续的软件分析和人工确认，建立了单抗药物简单、快速的 De novo 质谱测序分析流程，为未知氨基酸序列蛋白药物的分析和确认提供了质谱方法，有望大规模应用于生物制药企业的早期研发中。

方案下载
配置单
方案详情

    抗体药物的特异性和有效性高度依赖于抗体的氨基酸序列和抗体上存在的特异性翻译后修饰。在单克隆抗体的研发阶段，主要是通过DNA测序来进行初次验证，但是对于一些预临床的抗体药物，可能来自于免疫的宿主、商业化的抗体产品、合作实验室的抗体样品或者来自于杂交瘤细胞的产物，很多都无法得到其cDNA序列；在这种情况下，我们需要直接在蛋白水平进行单抗分子的完整氨基酸序列及其翻译后修饰分析，从而解决预临床实验中存在的一些问题，同时对单抗产品的质量进行控制分析。
     在没有蛋白氨基酸序列的前提下进行蛋白的氨基酸序列和翻译后修饰分析称为蛋白从头测序（de novo sequencing）。实现蛋白从头测序主要有两种方法：Edman 降解法和质谱分析法。Edman 降解法一般适合 15-20 个氨基酸组成的肽段，不能超过 30 个氨基酸，且对于样品纯度要求也比较高，至少 97% 纯度以上；同时还要进行蛋白酶解、肽段分离纯化和肽段逐一上机测试，另外，对于一个单抗进行 Edman 降解测序的时间成本和经济成本也比较高。而与传统的 Edman 降解法相比，基于质谱的方法更加高通量、高效率和低成本，即使在已知蛋白氨基酸序列的情况下，从头测序的方法也可以发现一些新的蛋白变体，这些蛋白变体可能来自未知的突变、剪切拼接和各种翻译后修饰，从而为单抗序列提供更加全面的信息，因此基于质谱的蛋白 de novo 测序法已经逐渐进入生物制药产品的研发阶段。
    质谱从头测序的方法简单、快速并且直接，但是也存在很多挑战：为了得到尽可能丰富的碎片信息，我们需要采用多种酶酶切和多种质谱碎裂方式组合的高分辨、高质量精度质谱进行数据采集，然后通过蛋白 de novo 测序软件的分析和拼接，得到最终的单抗氨基酸序列信息，分析流程如图 1 所示。在此，我们使用了 Trypsin，Chymotrypsin，LysC，GluC 和 AspN 5 种酶进行多酶酶切，同时使用我们最新的三合一超高分辨质谱 Fusion Lumos 进行高质量的高能碰撞解离（HCD）和电子转移解离（ETD）数据采集。目前，在质谱数据采集过程中，常用的碎裂方式为：碰撞诱导激活解离（CID）和高能碰撞解离（HCD）两种解离方式，由于 HCD 碎裂产生的二级原始谱图的质量更好，与理论的匹配度更高，因此我们更多的采用 HCD 来进行二级碎裂，产生相应的 b，y 碎片离子。而电子转移解离（ETD）作为一种补充碎裂方式，可以产生与 b，y 离子互补的 c，z 离子，从而更加准确的确定氨基酸序列；另外 ETD 可以保留侧链易于丢失的一些翻译后修饰基团，比如磷酸化基团，因此可以准确的确定蛋白质翻译后修饰的位点；同时由于电子转移的特征，ETD 偏向于碎裂带电荷数目比较高、质核比相对比较低的肽段，从而可以实现一些大肽段的有效鉴定。综合考虑，ETD 与 HCD 相互结合，可以准确确定完整的氨基酸序列以及翻译后修饰位点的信息。

    本文基于最新的三合一超高分辨质谱平台Fusion Lumos,Trypsin，LysC，Chymotrypsin，GluC 和 AspN 5 种酶进行多酶酶切，采用 HCD 和 ETD 两种互补碎裂方式，以及后续的软件分析和人工确认，建立了单抗药物简单、快速的 De novo 质谱测序分析流程，为未知氨基酸序列蛋白药物的分析和确认提供了质谱方法，有望大规模应用于生物制药企业的早期研发中。

上一篇 高压离子色谱Inuvion快速测定自来水中的常见阴离子
下一篇 TSQ Quantis 三重四极杆质谱仪性能大提升 完美应对食品安全领域目标定量新挑战

文献贡献者

赛默飞色谱与质谱
钻石会员 丨 第23年
查看全部资料
相关仪器 更多
相关方案
更多

相关产品

当前位置： 赛默飞色谱与质谱 方案 快速深度单克隆抗体 De novo 测序

关注

拨打电话

留言咨询