全血/血清/血浆null检测 | 采用蛋白质沉淀与固相萃取对人血浆中的花青素苷代谢物进行 UHPLC-MS/MS 三重四极杆分析以确定食物中的摄取量-安捷伦科技(中国)有限公司

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应用领域	医疗/卫生
检测样本	全血/血清/血浆
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参考标准	暂无

事实表明，生物样品的基质效应是造成液质联用 (LC/MS) 方法的不稳定与不准确性的原因。在本研究中，我们开发出了一种用于分析人血浆中花青素苷代谢物的方法。此外，我们通过提取人血浆中五种不同花青素苷代谢物比较了蛋白质沉淀 (PPT) 与固相萃取 (SPE) 这两种不同的样品前处理技术。血液样品采集自饮用草莓饮料（40 g 冷冻干燥草莓粉）0、2 及 3 小时后的健康女性志愿者（年龄 20 - 35 岁）。采用 PPT 方法时，在血浆 (500 µL) 中加入酸化乙腈 (1.5 mL)，然后涡旋并离心。收集上清液并用氮气吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用 SPE 技术时，先将稀释后的血浆样品加载至 SPE 管（Agilent Bond Elut Plexa，3 mL）中，然后用水冲洗，最后收集酸化甲醇的洗脱液。将收集的洗脱液在氮气下吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用三重四极杆液质联用系统对花青素苷类/代谢物（矢车菊素-3-葡萄糖苷 (C3G)、矢车菊素-3-芸香糖苷 (C3R)、天竺葵素-3-葡萄糖苷 (P3G)、天竺葵素-3-芸香糖苷 (P3R) 及天竺葵素葡糖苷酸 (PG)）进行鉴定与定量分析。

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配置单

安捷伦 1290 Infinity 二元液相色谱系统（1290 LC）
型号：1290 Infinity 二元

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Agilent 1290 Infinity II Multisampler
型号：1290 Infinity II Multisampler

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摘要

事实表明，生物样品的基质效应是造成液质联用(LC/MS) 方法的不稳定与不准确性的原因。在本研究中，我们开发出了一种用于分析人血浆中花青素苷代谢物的方法。此外，我们通过提取人血浆中五种不同花青素苷代谢物比较了蛋白质沉淀(PPT) 与固相萃取(SPE) 这两种不同的样品前处理技术。血液样品采集自饮用草莓饮料（40 g 冷冻干燥草莓粉）0、2 及3 小时后的健康女性志愿者（年龄20 - 35 岁）。采用PPT 方法时，在血浆(500 μL) 中加入酸化乙腈(1.5 mL)，然后涡旋并离心。收集上清液并用氮气吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用SPE 技术时，先将稀释后的血浆样品加载至SPE 管（Agilent Bond Elut Plexa，3 mL）中，然后用水冲洗，最后收集酸化甲醇的洗脱液。将收集的洗脱液在氮气下吹干，以待进行三重四极杆液质联用分析。采用三重四极杆液质联用系统对花青素苷类/代谢物（矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)、矢车菊素-3-芸香糖苷(C3R)、天竺葵素-3-葡萄糖苷(P3G)、天竺葵素-3-芸香糖苷(P3R) 及天竺葵素葡糖苷酸(PG)）进行鉴定与定量分析。

在样品前处理流程后加入与基质匹配的标准品，用此进行分析，这些代谢物可获得出色的线性和检测限。在饮用后2 小时可观察到花青素苷代谢物达到浓度峰值。与PPT 的样品相比，SPE 的样品中P3G 和PG 含量明显更高(p < 0.05)。然而，C3G、C3R 和P3R 的含量在这两种技术之间并没有差异。取决于化合物的不同，这两种方法的化合物回收率范围分别为4.2% - 18.4% (PPT) 与60.8% - 121.1% (SPE)。结果表明采用SPE 的样品前处理方法可使浓缩的花青素苷代谢物具有更高回收率。

前言

花青素苷类属于黄酮类的多酚物质。它们在浆果、苹果、卷心菜、玉米、葡萄、土豆等红色、蓝色或紫色水果和蔬菜中含量丰富。它们不仅会使水果与蔬菜呈现鲜艳的红/紫色，而且还对种子传播和授粉具有重要作用。花青素苷类的基本结构包括黄详盐阳离子(C6-C3-C6)，这一结构可与不同的糖、羟基或甲基连接形成不同类型的花青素苷类。此外，糖残基可被芳香酸/脂肪酸酰化[1]。花青素苷类的糖苷配基（不含糖）称为花青素类，其中六种主要类别为矢车菊素、芍药素、花翠素、天竺葵素、锦葵色素及牵牛花色素[2]。摄入富含花青素苷类的饮食对健康有益，对高血压、心血管疾病、糖尿病、肥胖及增龄性神经退行性障碍等一些疾病具有预防作用[3]。

在浆果中，草莓是花青素苷类的主要来源。根据种类的不同，草莓中总花青素苷的含量为20 - 60 mg/100 g 鲜重[4]。天竺葵素-3-O-葡萄糖苷是草莓中的主要花青素苷(83%)，随后依次是天竺葵素-3-O-芸香糖苷(8%) 及矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(7%) [4]。草莓中花青素苷类的结构如图1 所示。花青素苷类能以糖苷形式被人体吸收，但其生物利用度极低。人们已开展临床试验研究不同浆果中的花青素苷类对健康的益处。研究人员在方法开发中面临的主要挑战是这些化合物在血液中含量极低，而且它们对pH 较为敏感，在酸性条件下较稳定。因此，需要采用有效的提取技术来提取血浆中的花青素苷代谢物。蛋白质沉淀(PPT) 因其低廉的成本与简单的操作成为了最常用的生物样品前处理方法，但结果通常无法确保准确性与重现性。而固相萃取(SPE) 因其较好的回收率和重现性而越来越多地应用于HPLC 分析前的样品净化。这种技术还可用于代谢物浓缩并能减少血浆基质中其他不必要化合物的干扰。

本应用简报介绍了上述代谢物分析的方法学，其中包括PPT 与SPE 在提取人血浆中花青素苷类/代谢物时的比较。样品净化流程对Agilent Bond Elut Plexa SPE 小柱与传统蛋白质沉淀方法进行了对比。

结论

采用三重四极杆LC/MS/MS 分析可准确测定人血浆样品中摄入极低浓度糖基化的花青素苷类及其代谢物。采用SPE 可提高方法的回收率、准确度和精密度。MRM 的高灵敏度可提供分析所需的灵敏度和选择性。这些研究有助于深入了解促进健康的这些化合物的潜在使用情况。

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文献贡献者

安捷伦科技(中国)有限公司

钻石会员丨第23年

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