重组蛋白表征——完整蛋白质的鉴定、纯度和杂质分析

2018/08/02   下载量： 21 次

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尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。 完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS) 技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱 (SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

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尽管蛋白质生物制品总体来说是相对稳定的分子，但是在生产、制剂和储存过程中，还是会发生一些化学修饰和降解反应。许多蛋白质在纯化过程中可能发生水解断裂，而断裂形成的片段污染物可能会导致患者免疫反应的不良后果。由于存在化学修饰和降解反应，因此需要可靠而且灵敏的方法来评价研发和生产过程中蛋白质的纯度和结构完整性。

完整蛋白质、完整亚基或结构域的精确质量测定对于蛋白质序列组成的快速确认和翻译后修饰、降解和样品处理引起的分子变异的鉴定非常有帮助。电泳、色谱和质谱 (MS)技术是完整蛋白质及其降解物分子量测定的最常用技术。其中一种最常用的分析是体积排阻色谱(SEC)，它用于测定蛋白质是否为单体结构，并且在生产和制剂过程中是否始终保持这一结构。

SDS 电泳可用于精确测定蛋白质的分子量和纯度，全自动芯片系统能够监测研发和生产的整个过程。安捷伦2100 生化分析仪设计用于自动分离和定量测定广泛的蛋白质。大分子糖基化蛋白由于含有很大的糖基，很难用电泳方法进行分离。然而如果去除糖基，则可得到更好的分离和更准确的分子量测定。此外，很多不同种类的结构，包括糖基化、去糖基化和各种异构体都可以用安捷伦2100 生物分析仪进行很好的分离和检测。

蛋白质生物制剂分子量测定的首选方法是毛细管电泳(CE)。根据检测器的不同可有多种方法，从CE/UV 或CE/LIF（激光诱导荧光检测），到兼具激光诱导荧光检测和质谱检测的联用方案CE/LIF/MS。由于毛细管电泳主要是根据质量数、电荷和分子的形状进行分离的，因此它对于抗体的一级结构和糖基化状态的分析是一个很有效的工具。同时与LIF 检测器和飞行时间质谱(TOF) 联用进行单克隆抗体样品中微量成分的分析和检测可以获得前所未有的灵敏度（图1）。

液相色谱与飞行时间质谱(TOF) 或四极杆飞行时间质谱(QTOF) 联用也能为蛋白治疗药物提供高度准确的质量信息，其准确度超过了电泳方法。分析时间一般小于一小时，可以获得蛋白质和任何降解或修饰杂质的重要信息。例如，电喷雾(ESI) LC/QTOF 质谱在9 分钟内即可完成单克隆抗体的分析，质量准确度优于25 ppm，而且还可以获得样品中各种抗体相关杂质的信息。

很多具有治疗作用的蛋白质，包括单克隆抗体都是通过二硫键组成的蛋白质复合体。这些复合体可通过还原分解成亚单位，再通过HPLC/MS 进行分析。虽然完整单克隆抗体分析能够提供很多关于纯度和糖基化水平的信息，但分析二硫键的还原产生的轻、重链亚单位可以得到更多的信息。可以检测重链中糖基化的水平和类型，以及不需要的修饰，如非酶促和非特异的糖基化（图2）。

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安捷伦科技(中国)有限公司
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