蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤——
01 材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:
1. 机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
02 蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
03 蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:
1. 等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
04 样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
05 蛋白质的分析测定
通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定。蛋白质的分析纯化,不仅仅是选择合适的方法,必备的工具,例如微量均质器、干燥器、抗体保存盘等,也很重要。
Bel-Art蛋白质分析纯化工具推荐
本篇我们根据不同耗材在蛋白质分析纯化过程中的不同作用,分类为大家推荐几款合适的耗材。
细胞裂解 热门优选
微量均质器-手持式
货号:F65000-0000
研磨组织和破碎细胞
层析 热门优选
磁珠分离架
货号:F19900-000
分离结合在磁珠上的蛋白质以快速纯化
透析热门优选
透析袋夹持器
货号:F18237-0000
测定热门优选
贝塔盾
货号:F24976-0001
在进行C14分析时减少接触
电泳热门优选
Spindrive™ 轨道摇床平台
货号:F37041-0001
提供彻底、温和的凝胶混合,同时*限度地扩大实验室空间
研发笔记分享:甘油对冻干制剂机械强度的影响
分子蒸馏技术在天然维生素E分离提纯中的应用
高校展回顾第三弹:创新升级之旅仍在继续
当创新药研发“碰瓷”《黑神话悟空》
相关产品
英诺德INNOTEG EasyPrep MP中压制备色谱(自动过柱机)
英诺德平行合成仪EasySyn-12
INNOTEG磁力搅拌器WM-1
Biopharma Technology冻干显微镜LyoStat5
英国Genevac真空离心浓缩仪miVac DNA
美国SP Scientific冻干机
德国Hettich微量管离心机MIKRO200R
英国Genevac HT 3i系列溶剂蒸发工作站
平行浓缩仪GenevacEZ-2 4.0溶剂蒸发工作站
英国GeneVac 快速溶剂蒸发系统 Rocket Synergy2
Lauda ECO加热制冷恒温浴槽
德国Lauda Alpha加热制冷恒温器
美国pickering 柱后衍生化仪器
气体采样器SAMPLING CASE
浓缩仪英国GeneVac miVac真空离心浓缩仪QUATTRO系列
关注
拨打电话
留言咨询