所有生物系统中的细胞群都以其异质性而闻名。此外,基因组、转录组和蛋白质组细胞间的变异可能是不同病理的起源。为了评估细胞变异性,对目标群体中的单个细胞进行定量分析是目前一个关键的研究领域。
在过去的几年里,SC-ICP-MS已被用于分析单个细胞中的内源性元素,以更好地了解它们的生物学功能,研究金属纳米颗粒(NPs)的细胞内化,以及评估金属药物的摄取。此外,使用金属标记抗体可以确定细胞内的特定生物分子。SC-ICP-MS可用于细胞培养物中目标生物分子的高通量定量测定,但无法提供每个细胞内生物分子的分布情况。这可以通过使用LA-ICP-MS直接对细胞取样来克服。LA-ICP-MS是元素和同位素分析的强大工具,提供了从生物组织切片和细胞获得高分辨率图像的能力。
摘要
本文首次使用SC-ICP-MS和LA-ICP-MS作为互补技术来全面研究单个细胞中的靶蛋白:SC-ICP-MS检测蛋白,LA-ICP-MS定位亚细胞水平。为了实现显著扩增以检测细胞中低浓度水平的蛋白质,使用IrNCs标记的免疫探针(每个免疫探针平均1760个Ir原子)。本文顺序测定了在同一体外模型(人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19))表达的两种蛋白质(载脂蛋白E(APOE)和claudin-1),采用SC-ICP-MS和LA-ICP-MS对经葡萄糖(GL)氧化应激处理的培养细胞和未经处理的对照细胞进行分析。本文采用microFAST SC 单细胞/单颗粒样品引入系统进行SC-ICP-MS分析。该系统用于ARPE-19细胞传输时的传输效率为85±9%(使用PtNPs标准时为91±5%)。在细胞悬液中使用特异性IrNC免疫探针(SC-ICP-MS)进行适当的免疫细胞化学处理后,获得单个ARPE-19细胞中APOE和claudin-1的质量。SC-ICP-MS每个细胞的平均检出限为0.02 fg的APOE和3 ag的claudin-1。SC-ICP-MS获得的样品分析结果用商用ELISA试剂盒验证。LA-ICP-MS揭示了两种靶蛋白在单个细胞(固定在腔壁上)中的分布。IrNCs免疫探针提供的高扩增率允许在单个ARPE-19细胞中鉴定APOE和claudin-1。采用imageGEO激光剥蚀系统,2 × 2 μm的激光光斑获得高分辨率图像。
结论
首先,研究对SC-ICP-MS分析中的细胞进样浓度进行了优化,如图1所示,在使用microFAST SC 单细胞/单颗粒样品引入系统时,当细胞浓度为1 × 105 cells·mL-1时,检测到的事件数量足够大,可以获得具有代表性的数据,具有多个事件的可能性最小,信号背景比最大。因此,后续SC-ICP-MS分析中选择的细胞浓度为1 × 105 cells·mL-1。
图1 SC-ICP-MS 分析中ARPE-19细胞浓度优化
随后,对比了不同抗体浓度和清洗次数对SC-ICP-MS检测到事件数的影响(图2),结果表明,在抗体浓度为10 μg·mL-1、清洗2次的条件下,可确保有过量的抗体来识别所有蛋白质,能有效去除过量的免疫探针,并且不会损失过多细胞。
图2 不同抗体浓度和清洗次数对单个ARPE-19细胞中Ir免疫探针分析的影响
使用上述优化条件对分别葡萄糖(GL)氧化应激处理和对照组(CT)细胞中的APOE和claudin-1蛋白进行了SC-ICP-MS分析,其质量频率直方图如图3所示。结果显示,GL处理中约30%的细胞受到高血糖诱导氧化应激的显著影响,这些细胞中APOE的质量在0 ~ 0.05 fg/cells之间。CT组中38%细胞的claudin-1质量在5-10 ag/cell之间,而GL细胞只有21%在这个范围内。GL处理也增加了claudin-1质量的细胞百分比,在50-500 ag/cell范围内。
图3 CT和GL处理下APOE和claudin-1蛋白质量频直方图
最后,本研究将单个ARPE-19细胞固定在孔室中培养,并通过LA-ICP-MS评估目标蛋白在单个细胞中的分布。采用imageGEO激光剥蚀系统,2 × 2 μm方形激光光斑(表1),优化实验条件,兼顾高空间分辨率和灵敏度。激光能量密度设置尽可能低,但仍会导致整个细胞体积的消融。所有分析的ARPE-19细胞具有相似的厚度,并且在整个成像过程中调整了相同的扫描焦点。图4A和B显示了APOE蛋白在单个CT和GL处理的ARPE-19细胞中的分布,图5A和B显示了claudin-1蛋白在单个CT和GL处理的ARPE-19细胞中的分布。LA-ICP-MS证实,在相同的细胞群中,蛋白质分布在细胞间也是不同的。
图4 IrNCs免疫探针标记的APOE蛋白在CT和GL处理的ARPE-19细胞中分布
图5 IrNCs免疫探针标记的claudin-1蛋白在CT和GL处理的ARPE-19细胞中分布
(备注:中文译本仅供参考,以英文原版为准)
论文链接
扫一扫,查看原文
ESI microFAST SC 单细胞/单颗粒样品引入系统
ESL imageGEO 激光剥蚀系统
仪器详情请咨询凯来仪器
凯来谱
上海凯来谱科技有限公司专注提供激光剥蚀相关联用技术的应用开发和分析测试服务,围绕全新飞秒激光及传统193准分子激光技术打造的联用测试系统(LA-LIBS-ICPMS),引领激光剥蚀联用技术在各行业的应用,积极参与业内重点实验室合作开发,应用成果已于近期陆续发布中!
跨越山河,稳定如初丨凯来邀您相约贵阳第十七届全国矿床会议现场体验
但愿人长久,千里共婵娟丨凯来祝大家中秋快乐
GenesisGEO飞秒功能上新丨凯来邀您相约武汉Geoanalysis2024现场体验
【网络研讨会】LA-TOF-ICP-MS:地球化学成像技术的突破与应用
相关产品
上海凯来GenesisGEO新型飞秒激光剥蚀系统
ESLumen LIBS: LIBS & LA-ICP-MS 同步进行
ESLfemto 飞秒激光剥蚀系统
ESLimageGEO 激光剥蚀系统(地质成像)
ESL193HE 高能量准分子激光剥蚀系统
Artifact 双样品仓激光剥蚀系统(文博考古)
Vitesse飞行时间等离子体质谱仪(TOF-ICP-MS)
LaserTRAX 高通量全自动激光剥蚀系统
ESLimageBIO266 激光剥蚀系统(生物成像)
ESL213 灵活的激光剥蚀系统
MIR 102 激光熔融加热系统
MicroMill2 高精度微区取样仪
Iolite v4 多功能数据处理软件
prepFAST SE 超纯化学品自动加标系统(半导体应用)
prepFAST SF 超纯化学品全自动在线稀释系统 (半导体应用)
关注
拨打电话
留言咨询