文献分享：基于VLP基因递送载体的质量分析与表征

纳米技术广泛应用于FDA监管的药物试验中，如人用药物产品/生物制品、纳米材料（Nanomaterial）为活性/非活性成分的（载体类）药物等。近年，伴随新冠疫情全球肆掠，人

类的健康，生产，生活产生受到严重的影响。以纳米材料为载体的新型疫苗和药物的开发，成为全球药物科学家重点关注的技术平台和应对新冠疫情以及新兴疾病的强力技术手段。目前研究的热点递送系统包括：外泌体，高分子聚合物，脂质纳米颗粒，病毒以及病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLPs）等。而在传统纳米药物以及新冠药物/疫苗研发过程中，VLPs是重要的递送系统之一（图1 Jeyanathan, et al. Nature 2020）。

VLPs是一类由不同结构病毒蛋白Viral Proteins（VP1，VP2，VP3，）组装而成的颗粒。目前基于VLPs技术商业化的药物/疫苗：乙型肝炎病毒（Hepatitis B，HBV）疫苗，人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）疫苗等，其生物学特征/特点、安全性，以及符合GMP标准的大规模生产工艺等均已相当成熟。目前基于VLPs开发新冠药物/疫苗疫苗中有一种药物进入临床试验，12种处于临床前的开发阶段。在VLPs药物生命周期中，质量表征和稳定性分析面临各种挑战，需要选择高效，可靠，经济性高的技术手段进行分析表征。电镜（Electron microscopy，EM），分析型超速离心（Analytical Ultra-Centrifugation, AUC）技术可以从视觉和分离上提供直观而有价值信息，例如粒径大小及其分布等，但在实际工业化应用中存在耗时长，成本高，通量低等不足[1]。

拜耳科学家Andrzej等（Bayer healthcare pharmaceuticals，USA）开发了场流分离检测技术（Field-Flow Fractionation Combined with Multi-Angle Light Scattering , FFF-MALS）分析和表征人多瘤病毒的病毒样颗粒VLP递送系统（JC-Virus，JCV），解决了在过程开发中面临的挑战性难题：

a) 分析效率：单个样品分析仅需30~45min；

b) 高通量：自动进样器连续进样；

c) 可靠性：基于HPLC，增强方法的可操作性，提高数据的稳定性（准确度和精密度）；

d) 消耗量：低样品消耗（0.5mg/uL，100 uL）

e) 多参数分析：分子量及其分布，尺寸及其分布（Rg和Rh），浓度等;

f) 杂质分析：多组分含量，聚集体/纯度，异质性等。

样品和分析方法

分析样品：人多瘤病毒的病毒样颗粒（Human polyma JC-Virus）

分析手段：纯化ÄKTA explorer(Cytiva)；分析FFF-MALS, DLS (Wyatt Technology)

结果与讨论

1.分析粗提VP1-VLP样品

通过昆虫细胞Sf158表达VP1-VLP蛋白，经过一定的纯化步骤，获取VP1-VLP样品。VP1理论分子量为39.6kDa，可形成五聚体结构（Pentamer, ~198kDa），而JCV VLP由72个五聚体形成，其分子量~14,250kDa；通过FFF-MALS初步检测分析（图2），表达系统中不仅观察到VLPs存在（峰2），其分子量17,000kDa（含少量的VLP聚集体），粒径20nm；同时也观测到一部分少量的VP1形成的聚集体，但以低的寡聚形式存在（峰1），其分子量为2500kDa。通过进一步的实验表明VP1低的寡聚无法包装DNA，且随着昆虫细胞Sf158表达时间的延长，该组分会消失。同时，也可以通过纯化方式的改变剔除该组份（调节NaCl浓度）。

2.分析纯化后VLP样品

        通过进一步的条件优化（细胞表达和纯化条件的优化），获取纯度较高的目标VLPs样品。通过FFF-MALS分离与检测，其结果表明目标VLP单体的均方根半径20.5nm，流体力学半径24nm；依据结构分析（Shape factor，Rg/Rh）0.85，说明其为球型的空心结构(左图)。而右图显示其单体分子量16,400.00kDa结合此处DAD检测器中260/280nm比值，说明VLP单体中可能存在少量核酸杂

质（可能来源于宿主细胞）。

3.分析裂解样品VLP中的VP1五聚体

使用DTT和EGTA对VLP裂解处理，优化裂解条件（1. Optimized-蓝色；2. 90mM Sodium Bicarbonate-红色；3. 150mM NaCl-绿色）。样品处理过程中使用动态光散射技术（DLS）监控不同条件下的裂解情况（图4左）；并使用FFF-MALS继续分析裂解后的样品状态（图4右）。从FFF分离情况看，蓝色色谱图信号位于10-15min处，VP1五聚体含量最高；

通过进一步对裂解条件优化，并对样品纯化，获取VP1五聚体组分（200kDa），其结果如图5所示；而同步采用SEC方法分析，无法检测到对应的VP1信号，可能样品与SEC填料存在强吸附现象；

总结

 FFF-MALS技术在制剂条件下快速准确分析VP1-VLPs的特征参数：分子量，尺寸，聚集的形态等；解决了在VP1-VLPs过程开发中面临的多重挑战性问题。因此，该技术是纳米载体药物质量控制，工艺优化中不可或缺的重要工具。

编译：怀雅特-LJ-ZTL

时间：2022年06月30日

关键词Key words：类病毒颗粒VLP 基因治疗 核酸药物 递送载体 结构表征 光散射 粒径 动态光散射 FFF-MALS

分类：FFF-MALS，DLS

Reference:

(1)Citkowicz A, et al. Characterization of VLP assembly for DNA delivery using asymmetrical flow field-flow fractionation and light scattering[J].

(2)FDA guidance for Industry: Drug products, including biological products, that contain nanomaterials

(3)Jeyanathan, et al. Nature.2020