AAV空实心率测定方法对比研究

美国怀雅特技术公司北京代表处

2023/07/12 10:21

AAV空实心率测定方法对比研究

腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)属于细小病毒科依赖病毒属,无包膜，由直径约为 22 nm 的二十面体蛋白质衣壳和约 4.7 kb 的线性单链 DNA 基因组组成。由于其较低的免疫源性，外源基因在体内表达时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。随着AAV基因治疗的持续升温，美国USP和中国CDE也相继推出基因治疗产品研究与评价技术指导原则。其中AAV空实心率（基因组滴度Vg、衣壳蛋白滴度Cp）的表征作为关键参数用于指导后续临床药效和毒理等研究，目前常用冷冻电镜(cryo-EM)表征AAV颗粒形貌；使用SV-AUC、SEC-MALS、UV-VIS、ddPCR/ELISA等方法测定AAV的基因组滴度、衣壳蛋白滴度和空实心率。

目前SV-AUC常做为表征AAV的空实心率的“金标准”，但低通量、高样品损耗、无法GMP等问题导致其使用环境受限。为了探究一种稳健、高效的方法，本文对比了SV-AUC、SEC-MALS、UV-VIS、ddPCR/ELISA法测定AAV的基因组滴度、衣壳蛋白滴度及空实心率等关键质量参数。

1、Vg和Cp测定

ddPCR/ELISA法SEC-MALS法均通过测定AAV样品的Vg和Cp从而计算样品的空实心率，

如图所示，6组AAV样品结果表明SEC-MALS法和ddPCR/ELISA法测定Vg和Cp的一致性较好，但是SEC-MALS法测定结果的重复性、准确性均优于ddPCR/ELISA法。

2、空实心率测定

通过对比SV-AUC、SEC-MALS、UV-VIS（以stunner为例）、ddPCR/ELISA法测定AAV空实心率（如下图所示）, SEC-MALS和SV-AUC结果保持较好的一致性，而UV-VIS法（以stunner为例）由于无法分离、杂质影响等原因，与真实结果偏离较大。对比发现，SEC-MALS的易操作性（液相方法）、重复性好、准确度高、高效（15min测定）等特点使得其作为AAV的明星手段。

3、IEX-MALS测定AAV空实心率

基于SEC-MALS测定AAV的基因组滴度、衣壳蛋白滴度及空实心率的基础上，Wagner等研究采用IEC分离取代SEC分离，从而使得AAV空心与实心样品在色谱上达到分离效果（如下图）。通过对于回收率、重复性、线性、AEX色谱柱选择、洗脱梯度等全方面评估，结果表明IEC-MALS在有效分离空实心AAV基础上，仍然可以高效准确的测定AAV的基因组滴度、衣壳蛋白滴度及空实心率，为AAV质量参数表征测定提供了新思路。

总结

综上，相较于其他测定方法， SEC-MALS具有低开发成本、重复性高、高效准确的特点，是一种稳健高效的方法，从而被USP/CDE机构推荐用于测定基因治疗产品。

[1] Bryan Tr, I-Wei T, Kinjal S, et al. Application of Size Exclusion Chromatography with Multiangle Light Scattering in the Analytical Development of a Preclinical Stage Gene Therapy Program.

Human Gene. Therapy.Apr 2023.325-338.http://doi.org/10.1089/hum.2022.218

[2] Wagner C, Innthaler B, Lemmerer M,et al. Biophysical Characterization of Adeno-Associated Virus Vectors Using Ion-Exchange Chromatography Coupled to Light Scattering Detectors. International Journal of Molecular Sciences. 2022; 23(21):12715. https://doi.org/10.3390/ijms232112715

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