方案摘要
方案下载应用领域 | 食品/农产品 |
检测样本 | 水产品 |
检测项目 | 营养成分>风味品质分析 |
参考标准 | 福林-酚试剂显色法 |
一、实验原理 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定
一、实验原理
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点:
1.选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。
2.用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。
3.有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。
4.在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。
酶活力的分析:通常是以对—硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯( pNP)在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法,详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
二、实验用品
(一)器材
(1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。
(2) 离心机。
(3) 超级恒温水浴锅。
(4) 酸度计。
(5) 722分光光度计。
(6)天平、台秤。
(7)透析袋。
(8)磁力搅拌器。
(9)冰箱。
(10)秒表。
(11)50µL微量进样器。
(二)试剂
(1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷1.214g,NaCl5.8g,溶于蒸馏水中,加入80ml 0.1mol/L HCL,用蒸馏水定容到1000ml。
(2)正丁醇(分析纯)。
(3) 硫酸铵(分析纯)。
(4) 0.5% NaCl:称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。
(5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3 pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL,(B)液30ml混匀,用酸度计准确调节pH 10.1。
(A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液:取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸馏水中 。
(B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液:取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸馏水中。
(6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液:称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中,稀释成1000ml。
(7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液:称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。
(8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液:取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL,混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。
(9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g,用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml,即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL,加蒸馏水约800ml,再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL,混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。
(10) 丙酮(分析纯)。
(11) 95%乙醇(分析纯)。
(12) 20 mmol/L Mgcl2:称取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸馏水中。
(13) 0.1 mol/L NaOH:称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。
(14) 20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。
(15) 底物溶液(5mmol/L pNPP):按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2:0.50:.28。
(16)0.5µmol/mL对硝基苯酚(pNP=141.1)溶液:精确称取17.64mg对硝基苯酚,用蒸馏水溶解并定容至250 mL。
(17) Folin甲 参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
(18) Folin乙 参考北京来亨科贸有限责任公司技术文章。
(三)材料
(1) 新鲜牡蛎。
(2) 新鲜兔肝。
三、实验程序
(一)操作方法
1.牡蛎碱性磷酸酶的分离提取
(1)称取100g牡蛎(蒸馏水洗净),加入150预先冷却的0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液(PH7.5,含0.1mol/L NaCl),于高速组织捣碎机匀浆1min,量匀浆体积,于冰箱4℃放置3h进行抽取。(留匀浆液10ml,采用离心或过滤,得到上清液,待测酶的比活力)
(2)缓慢加入20%(V/V)冰冷的正丁醇,边加边搅拌均匀。冰箱放置2~3h。
(3)室温离心,4000r/min 30min,收集离心上清液,并量体积。。(留5ml上清液,对含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液PH7.5透析平衡,待测酶的比活力。)
(4)在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度(100ml加入20.9g)。缓慢加人,不断搅拌溶解,置冰箱静置4 h。
(5) 室温离心,4 000 r/min 30 min,收集离心上清液,并量体积。(留5ml上清液,对0.01mol/L Tris.HCL 缓冲液PH7.5含0.1 mol/L NaCl透析平衡,待测酶的比活力)。
(6) 0.35 mol/L饱和硫酸铵上清液,加入固体研磨细粉的硫酸铵至 0.70饱和度(100ml加入23.8g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置4 h。
(7) 室温离心,4 000 r/min 30 min,收集沉淀物。(沉淀蛋白上浮,先把下面清液虹吸出来,余少量清液连同沉淀一起离心)
(8) 得到沉淀物,溶于20mL 含 0.1 mol/LNaCl 的 0.01mol/L ris.HCL 缓冲液PH7.5。装入透析袋,先对预冷的0.5% NaCl透析(常换透析液),至无S〇4-2被检测出为止(可用一定浓度BaCl2溶液检验)。再对0.01 mol/L Tris . HCl pH7.5缓冲液透析平衡。
(9) 取出酶溶液,冷冻高速离心(0℃: 25 000 r/min 30 min)。
(10) 离心上清液即为粗酶制剂,检测酶的比活力。装人棕色瓶于4℃冰箱保存。
2.兔肝碱性磷酸酶的分离提取
(1) 取2 g新鲜免肝剪碎后,置于玻璃勻浆管中,加入0.01 mol/L醋酸镁,0.01 mol/L醋酸钠 6ml,研磨2〜3 min。将匀浆倒入刻度离心管中,记录其体积。吸出0.1ml置于另一试管中,在此试管中加4.9ml PH8.8 Tris . HCl缓冲液稀释,待测比活力。
(2) 加2 ml正丁醇于匀浆中,用玻璃棒充分搅拌2 min左右,然后在室温中旋转20min。用滤纸过滤,滤液置于刻度离心管中。
(3) 滤液中加入等体积的冷丙酮,立即混勻后离心(2 000 r/min)5min,弃去上清液。在沉淀中加入0. 5 mol/L醋酸镁4 mL,用玻璃充分搅拌使其溶解,记录溶液体积。吸取0.1ml。置于另一试管中,在此试管中加入PH8.8 Tris . HCl缓冲液4.9ml,待测比活力。
(4) 在溶液中缓慢加人冷95%乙醇,使乙醇最终浓度达30%,混勻后离心(2000r/min)5min, 将上清液倒人另一离心管中,弃去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇,使乙醇最终浓度高达60%,混匀后离心(2 500 r/min)5 min,弃去上清液,沉淀中加人0.5 mol/L醋酸镁3ml,使其充分溶解,并记录体积。吸取0.2 mL置于另一试管中,加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液3.8ml,待测比活力。
(5) 上述溶液中逐渐滴加人冷丙酮。使丙酮最终浓度达33%。混匀后离心(2000 r/min)5 min,弃去沉淀,上清液则在另一刻度离心管中再缓慢加入冷丙酮。使丙酮最终浓度达50%。混匀后离心((4000 r/min)10 min,,弃去上清液,沉淀即为部份纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液4ml使其溶解,并记录体积,吸取0. 5 mL置于另一试管中,加入pH8.8 Tris . HCl缓冲液2 mL稀释,待测比活力。
3.比活力测定
(1)对硝基苯酚标准曲线的制作:取15支试管编号,0号一支,1~7号各二支,按表10-1操作:
以对硝基苯酚的绝对量(µmol/L)为横坐标,OD405值为纵坐标,绘制标准曲线。示出pNP的克分子消光系数(ε)值。
(2) 酶活力的测定:
取干净的试管21支,编号,0号一支作为空白对照,以缓冲液代替酶液;1~4号各3支,作为各步的酶样测定;1'〜4'各2支,作为相应的样品对照;各管加入1.98ml底物溶液(试剂9),于37℃恒温水浴中预热5 min, 1〜4号管分别加人各步酶样20µl,精确反应10min,各管加入2 mL 0.1 mol/L NaOH终止反应并显色,0号加入20µl Tris . HCl缓冲液代替酶液,1'〜4'管先加入NaOH后再分别补加对应的酶液20 µl 。以0号管调零点,于722分光光度计测定各管的OD405值,各个测定管的平均OD值减去对照管的平均OD值,从对照标准曲线求出产物的µmol数,算出酶活力。
(3)蛋白浓度的测定:
上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用Tris . HCl缓冲液稀释,稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定,以1步骤所提的碱性磷酸酶为例,一般第一步和第四步稀释40〜50倍,第二步稀释5〜10倍。第三步稀释2〜5倍。
取千净的试管13支,编号,0号一支作为空白试验,加入0.5 mLTris . HCl缓冲液稀释PH7.5;1~4号管各3支,作为各步的酶样测定,各管加人相应的已稀释的酶液0.5 mL;各管加入Folin-酚试剂甲 4 mL,室温放置10 min,再加入Folin-酚试剂乙0.5 mL,混勻,放置30 min。以0号管调零点,于 722分光光度计测定各管的OD650值,从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。
4.结果处理
计算:
式中:为透析后的体积变化系数;B为稀释倍数,C为由标准曲线査得的pNP(mol/L),t为反应时间,D为由标准曲线査得的蛋白的质量(mg),V1为测定酶活力所用的酶量(ml)。
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