方案摘要
方案下载应用领域 | 医疗/卫生 |
检测样本 | 全血/血清/血浆 |
检测项目 | |
参考标准 | 企业 |
生物膜的研究发展迅速,要研究生物膜的组成、结构及功能,首先必须分离出纯净的细胞膜。 分离状态下的哺乳动物的红细胞膜,一般称为“血影”。哺乳动物的红细胞中没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器,容易制备得到纯粹的细胞膜,取材方面来源也十分方便,是研究细胞膜的好材料。
实验原理
生物膜的研究发展迅速,要研究生物膜的组成、结构及功能,首先必须分离出纯净的细胞膜。
分离状态下的哺乳动物的红细胞膜,一般称为“血影”。哺乳动物的红细胞中没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器,容易制备得到纯粹的细胞膜,取材方面来源也十分方便,是研究细胞膜的好材料。
从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜,第一步是收集血液并置于加有抗凝剂的容器内,用低速离心的方法从血液中分离得红细胞,然后用等渗缓冲液重复洗涤多次,去除血浆。第二步,将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中,由于渗透压力作用于细胞质膜,使红细胞膨胀而溶血。最后一步,将溶血的红细胞经过充分反复洗涤,高速离心,去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。
二、实验用品
(一)器材
(1)冰冻离心机。
(2)相差显微镜。
(二)试剂
(1)pH7.4的等渗磷酸酸盐缓冲液
贮液A:称取0.780g磷酸二氢钠溶于水,定容至1000ml。
贮液B:称取3.582g磷酸氢二钠溶于水,定容于2000ml。
取380ml贮液A加1620ml贮液B,用少量浓HCL调PH至7.4,再称17.53gNACL溶于其中。
(2)PH7.4低渗Tris.HCL缓冲液:
贮液A:称取2.42gTris,溶于水,稀释至500ml。
贮液B:取0.84ml36%-38%HCL,稀释至500ml。
取500ml贮液A加414ml贮液B,用水稀释至近于2000ml,用6mol/L HCL调PH室7.4,再定容至2000ml。
(3)肝素-PH7.4等渗磷酸盐缓冲液:将肝素溶在PH7.4等渗磷酸盐酸缓冲液中,每ml含肝素500单位。
(三)材料
哺乳动物的血液。
三、实验程序
(一)操作方法
1.血液收集及红细胞的洗涤
将血液收集在含有抗凝剂的容器中,每30ml血液加约5ml肝素-PH7.4等渗磷酸盐缓冲液。为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化,以下操作应在0-4℃下进行。取30ml血液,于冰冻离心机中,4℃ ,3000r/min离心20min,使红细胞沉淀。用吸管吸血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层。这对于避免其他类型细胞的混入十分重要。
将红细胞置于3倍量预冷的PH7.4等渗磷酸盐缓冲液中,用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮,于4℃,5000r/min 离心15min,除去上清液及沉淀表层,重复洗涤3次。
2.溶血及红细胞膜的洗涤
在洗净的红细胞中,按照1:40的比例加入预冷的PH7.4低渗Tris.HCL缓冲液,边加边缓慢地搅拌,置于4℃冰箱中1-2h,使之完成容血。然后于4℃,9000r/min离心20min,使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3~5次,最后获得白色的红细胞膜样品。
3.细胞膜的镜检
取少量膜样品悬液,在相差显微镜下进行观察,确定膜制品是否纯净。在视野中应不含有完整的红细胞或污染的细菌。
4.膜蛋白含量的测定
取0.2ml膜样品悬液,用水稀释到1.0ml,制得膜样品稀释液。取0.1,0.2和0.5ml样品的稀释液用Folin酚试剂法测定膜样品中蛋白含量。
5.膜的冰冻干燥
剩余的膜样品放在一个称好重量的小称量瓶中,冰冻干燥至样品全干,称量带有冰冻干燥制品的小称量瓶,记录膜的产量 。将冰冻干燥的膜制品,置于干燥器中冰冻保存,以备膜结构成分的分析。
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