内容介绍
MicroRNAs (miRNAs)在控制各种细胞的生理过程中发挥着关键作用。在癌症等病理条件下,个体miRNA的表达水平可能会发生显著变化。如果能在单细胞水平上准确、定量的检测miRNA将有助于更好的理解miRNA的功能。虽然Northern印迹、PCR、纳米孔传感器和单分子荧光显微镜等方法都可以定量分析miRNA。但是由于浓度、灵敏度、可重复性等问题,这些方法仍有其局限性。韩国浦项科技大学的Joo Won Park等人报道了一种使用原子力显微镜直接检测miRNA的方法。(J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 36, 11664–11671)1通过扫描微米大小的DNA斑点,原子力显微镜可以量化单个神经元中的miR-134 RNA数量;可以在去膜后的固定神经元细胞上观察到单个miR-134 RNA分子。
图1 上半部分:为了定量化检测特定miRNA,从单个细胞中提取总RNA,并使目标miRNA与探针DNA点杂交;下半部分:在固定的单个细胞上绘制特定miRNA的原位分布,并使探针DNA与固定的miRNA杂交。利用连接HBD的原子力显微镜探针产生的力-距离力曲线中的特定粘附力来识别miRNA/DNA杂交物。单个的miRNA/DNA杂交物在粘附力图上呈现为一簇像素。
实验方法
作者将将N末端的人RNase H1蛋白通过表面修饰的方法固定在原子力显微镜针尖上。这种蛋白可以结合RNA/DNA杂交双链,称为杂交结合域(hybrid binding domain, HBD),在这里作者使用结构更稳定的DNA探针而不是RNA来检测mRNA。在实验中,修饰后的探针用于检测一种脑特异性miRNA,miR-134。这是一种能够调节脊椎生长和树突生成的脑特异性miRNA。
为了验证特异性的识别,作者首先将全部RNA从细胞中提取出来,并将其与固定在玻璃片上面积大约15-20平方微米的探针DNA斑点杂交。使用布鲁克ForceRobot原子力显微镜2进行单分子力曲线测试,实验结果发现粘附力大约在20pN上下,解离距离大约3.8nm。通过对比修饰后探针与单链ssDNA,双链dsDNA和双链dsRNA斑点以及经过RNase H处理后的斑点间的力曲线,可以确认这是一种特异性结合。在实验中,可以发现当AFM扫描像素点尺寸在4nm时,miR134的粘附力图为一个由34个像素点组成的团簇,并且在大多数像素点上观察到特异性结合的概率不低于40%。这一团簇可以被拟合为一个椭圆,等效圆半径14nm。这一尺寸与结合构型中的分子尺寸一致。通过是否产生粘附力团簇、特异性结合产生的概率即可判断原子力显微镜探针是否检测到了目标mRNA分子。
图2 对miR-134进行选择性识别。miR-134和pre-miR-134分别与单个的探针DNA点杂交。在识别miR-134的探针DNA斑点时,观察到了在粘附力图像中的聚集现象。相比之下,在识别pre-miR-134的探针DNA斑点上没有观察到聚集的粘附力。在粘附力力图中,每个像素上观察到特异性结合概率以灰度显示(30 × 30像素,240 × 240 nm2)。
根据估计,单个miRNA种类在细胞中的平均拷贝数约为500。为了确保能在单个细胞中识别目标miRNA,作者使用FluidFM探针3制备了直径为3-8 μ m的探针DNA斑点,通过将合成miR-134溶液(10-100 aM,40 μL中含有240-2400个拷贝)孵育在其中一个斑点上来评估识别效率。作者在每一个样品的每一个斑点中的三个任意位置记录粘附力数据并取平均值,计算了每个斑点上识别到的miR-134数目。通过线性回归,作者计算出DNA斑点上miR-134的识别效率为78%。
图3 DNA斑点上的miR-134。(a)在方格图案化的玻璃片上生成的探针DNA(在3'端修饰Cy3)斑点的共聚焦显微镜图像。比例尺,10 μm。(b)在单独的DNA斑点上检测10-100 aM(240-2400个拷贝)的miR-134(30 × 30像素,300 × 300 nm^2)。观察到特异性miR-134力曲线数量与样品溶液中miR-134的初始数量之间呈线性相关,并且从线性回归的斜率计算出捕获效率为78%。(一个实心圆表示两个数据点重叠。)
在验证了这一方法可以成功识别体外RNA后,作者进一步将这一方法应用于单个海马体神经细胞上。使用进行修饰后可以与miR-134互补的原子力显微镜探针,作者在神经元体的随机位置进行了力曲线测试。作者使用布鲁克NanoWizard原子力显微镜4对MAP2免疫染色标记的神经元在AC模式下进行成像,并选择了三个位置进行粘附力测试(100×100像素,1.0×1.0 μm2),在同一位置得到细胞荧光图像、原子力显微镜图像与力曲线数据(图4)。在神经元体上,每个图像中可以观察到2-4个团簇。RNase H处理后同一区域中团簇的消失,这同样证实了观察到的粘附力曲线是具有特异性的。在固定的神经元上,只有当探针DNA与目标RNA杂交时才观察到合格的簇,而当互补RNA或乱序DNA杂交时则不会观察到团簇,这与在玻璃片上DNA探针斑点上获得的结果一致,即这一miRNA/DNA杂交是特异性检测。
图4 在固定的神经元上绘制miR-134分布。(a)海马神经元(DIV7),MAP2;绿色。(b)a中的方框区域进行原子力显微镜成像。(c)b中编号的区域在与miR-134互补DNA杂交后进行粘附力实验。(d)相同的区域在用相同的探针进行RNase H处理后重新测试,未观察到团簇。(c, d)黄色像素表示在五次测量中观察到特定粘附力超过一次的位置(100 × 100像素,1.0 × 1.0 μm2)。a中的比例尺为50 μm,b中的比例尺为20 μm。
为了进一步验证这种方法的准确性与特异性,作者还分析了在固定的神经元上膜去极化诱导的miR-134表达变化。在固定前,海马神经元(DIV7)通过KCl(40 mM)处理2小时以诱导去极化。在受刺激的神经元(1.0×1.0 μm2)的区域内平均观察到了9.9个团簇,而在未受刺激的对照神经元中仅检测到了2.7个簇(见图5)。使用共聚焦显微镜观察c-Fos的表达增加,进一步验证了KCl刺激神经元的效果。虽然需要进一步研究了解AFM探针的压入深度和样品制备的影响,但这种直接的AFM粘附力图像观察到的簇数增加与在DNA探针斑点上通过提取出RNA进行宏观评估的结果一致。同一细胞上不同位置和同一条见下不同细胞间miR-134数量变化很小,证明了其在DIV7海马体神经元内是全局性表达的。
作者通过建立了一种基于原子力显微镜的粘附力成像新型miRNA定量方法。这种方法的灵敏度足以在单个细胞中分析特定miRNA的拷贝数,而无需修饰、逆转录或扩增。同时可以实现单个miRNA的原位测试。结合AFM的高分辨率特性,这种方法同样适用于神经元的其他区域,如树突和突触。如果借助快速原子力显微镜,将能够高效地可视化单个细胞的整个表面。此外,使用固定细胞和组织的切片能够检查细胞的内部和特定的细胞亚结构。这种新的分析方法为理解miRNA的生物学作用及其细胞间变异提供了新的途径。在生物样品中检测少量的miRNA生物标志物将使得这种方法能够作为一种可行的癌症诊断工具。
图5 神经元细胞通过膜去极化诱导增强表达miR-134。(a)未受刺激的海马体DIV7细胞与在固定前经过40 mM KCl 2小时刺激的细胞。二者均经过MAP2免疫染色。(b)原子力显微镜图像。a比例尺50 μm,b比例尺20 μm。(c)在神经元体上随机位置测试得到的粘附力图像。测试位置在b中用蓝色箭头标注。(100 × 100像素,1.0 × 1.0 μm2)特异性粘附力产生概率超过20%的区域用黄色标注,团簇用红色圆圈标注。(d)在三个神经细胞上分别进行了三个不同位置的miR-134团簇检测。
1. Visualization and Quantification of MicroRNA in a Single Cell Using Atomic Force Microscopy (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27529574 )
在这篇文章中,作者使用了三种布鲁克生物型原子力显微镜或附件:
2. 布鲁克ForceRobot® 400生物型AFM结合了许多独特的力谱创新技术以在单分子水平上测量力。它能够量化单个分子键的机械强度,并对分子相互作用和生物分子复合物的力依赖特性进行表征。 (https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-forcerobot.html)
3. FluidFM中空探针配件可以轻易的与布鲁克生物型原子力显微镜结合,可以轻松的处理微量液体。(https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/bioafm/bioafm-accessories/fluidfm-add-on-from-cytosurge.html)
4. NanoWizard® 4 XP生物型原子力显微镜可置于倒置光学显微镜上,对从单分子到活细胞和组织的样品进行长期实验,具有优异的机械和热稳定性。(https://www.bruker.com/zh/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-4-xp-bioscience.html)
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