【飞诺美色谱】猪肉中己烯雌酚残留量检测 LC-MS/MS法

艾杰尔飞诺美

2024/04/01 16:53

己烯雌酚(Stilbestrol)是人工合成的非甾体雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用。主要用于雌激素低下症及激素平衡失调引起的功能性出血、闭经，还可用于死胎引产前，以提高子宫肌层对催产素的敏感性。孕妇服用此药，其女性后代在青春期后宫颈和阴道的腺病及腺癌发生率升高，男性后代生殖道异常和精子异常发生率也增加。己烯雌酚可导致恶心，呕吐，食欲不振，头痛等症状，长期使用可使子宫内膜增生过度而致子宫出血和肥大。

国标中规定了在牛猪肝肾和肌肉组织中己烯雌酚方法检出限为1.0 µg/kg。

1.样品提取
称取5.00 g(精确到0.01 g)均质好的样品，置于50.0 mL 离心管中，加入15.00 mL 叔丁基甲基醚，涡旋1 min，振荡10 min，在-4℃下以 6000 rpm离心5 min，取上清液转入浓缩瓶中；用15.00 mL叔丁基甲基醚再提取一次，合并提取液，45℃水浴中减压悬蒸浓缩至干。加80%乙腈溶液2 mL 于浓缩瓶中，旋涡溶解残留物，然后将其转移至10 mL离心管中；再加入正己烷5 mL于浓缩瓶中洗涤，一并转移至离心管中，震荡混合1 min，在15℃以6000 rpm离心10 min，弃去上清液。再加正己烷5 mL于离心管中同法操作，留下层备用。

2.净化方法
先将Cleanert® PEP-2 (500mg / 6mL)小柱用3 mL叔丁基甲基醚、3 mL甲醇和3 mL水活化平衡，取上述下层溶液，以每3~4秒1滴的流速通过预处理后的固相萃取柱；先用甲醇:水(3:7，v/v)溶液3 mL冲洗，然后加水3 mL平衡，再用甲醇:2%氨水(1:9, v/v)溶液3 mL冲洗，弃去洗液，抽干。用0.1%甲酸/甲醇:叔丁基甲基醚(1:9，v/v)溶液7 mL洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用80%乙腈水1 mL溶解残余物，充分涡旋，过0.22 µm滤膜，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

3.检测方法

3.1色谱条件
色谱柱：Venusil® MP C18，2.1×50 mm，2.5 µm，100 Å；流动相：A相-水，B相-乙腈
柱温：35℃；进样量：5 µL；梯度洗脱：见表1

表 1 液相色谱梯度洗脱条件

时间(min)	流速 (mL/min)	A/%	B/%
0.00	0.35	85.0	15.0
1.50	0.35	85.0	15.0
4.00	0.35	10.0	90.0
5.00	0.35	10.0	90.0
5.01	0.35	85.0	15.0
7.00	0.35	85.0	15.0

3.2质谱条件
离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；电喷雾电压：-5500 V；雾化气压力：55 psi；
气帘气压力：12 psi；辅助气压力：50 psi；
离子源温度：550℃；采集方式：多反应监测(MRM)；
Q1、Q3均为单位分辨率，质谱参数(见表2)

4.实验结果
由表3可知，采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测己烯雌酚，加标量为2.5 µg/kg、25.0 µg/kg，回收率在80%~96%之间，RSD值在2.26%~8.95%之间，能够满足检测要求。由图1和图2可看出经Cleanert® PEP-2固相萃取柱净化，采用Venusil® MP C18色谱柱检测得到的己烯雌酚峰形良好，且保留时间稳定。

图 1 己烯雌酚样品加标 2.5 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图

图 2 己烯雌酚样品加标 25 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图

结论：
本实验建立了己烯雌酚残留量检测的LC-MS/MS检测方法，并结合固相萃取技术对猪肉中己烯雌酚的残留量进行了测定。对于加标量为2.5 µg/kg、25.0 µg/kg的样品进行了检测，回收率在80%~96%，符合国标要求，固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好，说明本方法能够用于检测动物源性食品中的己烯雌酚残留量。

5.订货信息

产品名称	规格包装	订货号
Venusil® MP C18	2.5µm,100Å,2.1×50mm	VA920502-0
Cleanert® PEP-2	500mg/6mL,30/pk	PE5006-2
保护柱套	适用于4.6×10mm和2.1×10mm	SH-100
直联式保护柱芯	2.5µm,100Å,2.1×10mm	VA920102-0S
1.5 mL样品瓶	短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk	1109-0519
1.5mL样品瓶盖	9 mm中心孔蓝盖，红色橡胶/米色PTFE隔垫,45．Shore A 1.0 mm,100/pk	0915-1819
针式过滤器(Nylon)	13mm,0.22µm,200/pk	AS021320
一次性注射器	2mL两件式无针头,100/pk	LZSQ-2ML
乙腈UV级	4L/瓶,色谱纯	015-4
正己烷HPLC	4L/瓶,色谱纯	AH216-4
甲醇	4 L/瓶,色谱纯	S230-4
己烯雌酚	标准品,100mg	GBW(E)060984

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