人工合成着色剂又称人工合成色素,常以苯、甲苯等 为原料,先制备色素中间体,再将一种或两种中间体进行 磺化、偶合、缩合和偶氮化等化学反应而制成。《食品中 合成着色剂的测定》(GB/T 5009.35-2003),采用聚酰胺吸附 食品中的人工合成着色剂,并用乙醇胺溶液进行洗脱。聚 酰胺对合成色素的吸附能力会受到温度的影响,实验时需 对样品和淋洗液做加热处理,而且乙醇胺浓缩所需时间过 长,此方法不适合大批量样品同时处理,且不易做自动化 方法移植。 大多数人工合成着色剂均具有苯磺酸钠结构,本实验 选用Cleanert® PWAX 混合型弱阴离子交换柱,用以吸附食 品中的合成着色剂,选用氨化甲醇洗脱,浓缩时间短,适 用于大批量样品的同时检测。
1. 样品溶液的配置 a) 乙酸铵溶液 (0.02 mol/L):称取 1.54 g 乙酸铵,加水 溶解并稀释至 1000 mL; b) 甲醇/甲酸 (6+4) 溶液:量取甲醇 60 mL,甲酸 40 mL,混匀; c) 柠檬酸溶液:称取 20 g 柠檬酸,加水至 100 mL 溶 解,混匀; d) 提取液a:量取无水乙醇 70 mL,氨水溶液 20 mL、 水 10 mL,混匀; e) 水 (pH为6.0):水加柠檬酸溶液调节 pH为6.0;2. 样品提取 a) 饮料类样品:称取 10 g 样品放入 100 mL 烧杯中,含 二氧化碳的样品加热去除二氧化碳; b) 配制酒类:称取 10 g 样品放入 100 mL 小烧杯中,加 热去除乙醇; c) 液体调味料:称取 10 g 样品放入 100 mL 小烧杯中, 若试样 pH 值偏高,用柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右; d) 固体调味料:称取 2 g 样品放入 100 mL 小烧杯中, 加入 10 mL 1% 氨水溶液,涡旋提取 1 min,4000 r/min 离心 5 min,重复提取至提取液无色,合并上清液,用柠檬酸水 溶液调节 pH 至 6 左右作为待净化液; e) 酱料类:称取 2 g 样品,加入 20 mL 石油醚,涡旋 混合1 min,5000 r/min 离心 5 min,弃去石油醚上清液,残 渣吹干,加入 10 mL 1% 氨水溶液,涡旋提取 1 min,4000r/ min 离心 5 min,重复提取至提取液无色,合并上清液,用 柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右作为待净化液; f) 果冻、水果罐头:称取已均质样品 2 g,装入 50 mL 离心管中,加入 5 mL 提取液a涡旋 1 min,4000r/min 离心 5 min,重复提取至提取液无色,合并上清液置于 80℃水浴中 浓缩至 2 mL,水洗转移至 10 mL 比色管中,用水定容(若试 样 pH 偏高,用柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右); g) 肉制品:称取已均质样品 2 g,装入 50 mL 离心管 中,加入 20 mL 石油醚,涡旋混合 1 min,4000 r/min 离心 5 min,弃去石油醚上清液。残渣吹干,加入 5 mL 提取液 a涡旋 1 min,4000 r/min 离心 5 min,重复提取至提取液无 色,合并上清液置于 80℃ 水浴中浓缩至 2 mL,水洗转移至 10 mL 比色管中,用水定容 (若试样 pH 偏高,用柠檬酸水 溶液调节 pH 至 6 左右)转移至卓睿全自动固相萃取仪上样 管中,待净化。 3. 固相萃取柱净化 SPE小柱:Cleanert® PWAX (150 mg/6 mL) Cleanert® PA (1 g/6 mL) 取以上两种固相萃取柱及上述提取液至 Qdaura® 卓睿全 自动固相萃取仪中,完成 SPE 净化过程:6 mL 甲醇,6 mL 水 (pH 值 6 ~ 7); 加样 10 mL; 6 mL 水 (pH为4)、6 mL 甲醇-甲酸(6:4)、6 mL 水(pH 值 6 ~ 7) 淋洗; 通入空气吹干小柱 5 min,6 mL 2% 氨化甲醇洗脱并接 收,收集液于 50℃ 氮气吹干,用 1 mL 水定容,过 0.45 µm 水 系滤器过滤,待测。
4. 实验条件 色谱柱:Venusil® XBP C18(L) 5µm 4.6 × 150 mm; 流 速:1.0 mL /min; 进样量:20 µL;波 长:254 nm; 梯 度:
5. 实验结果 5.1 Cleanert® PWAX SPE 柱添加回收实验 通过对不同基质样品的加标实验,对上述检测方法进 行验证,结果见下表:
5.2 赤藓红净化方法优化 赤藓红为苯甲酸钠结构,相对其他苯磺酸钠结构的着色 剂,在 SPE 小柱上保留较弱,国标《GB5009.35-2003》中赤 藓红的前处理方法是和其他色素不一样的,采用的是液液萃 取的方法。如按照 2.2 的净化方法操作,在淋洗阶段赤藓红 将全部被洗脱下来。通过方法优化,最终淋洗方法确定为 6 mL 水 (pH 值 6 ~ 7)、6 mL甲醇,选用 Cleanert® PWAX (150 mg/6 mL),其他条件不变,可满足同时处理9种着色剂的实 验要求。 注意事项 1) 若提取液呈碱性,在上样之前要将其pH值调节至6左右,保证小 柱对合成着色剂有良好地吸附; 2) 若样品酒精度过高,建议在上样前对样品进行除醇处理; 3) SPE小柱净化过程中,要注意对流速的控制,建议控制在1mL/ min左右; 4) 洗脱液氮吹复溶后,应选用水系滤膜过滤,防止因滤膜吸附造 成样品的损失,建议选用Hydrophilic PTFE 滤头。 5.3 结论 实验结果表明,Cleanert® PWAX 或者 Cleanert® PA 聚 酰胺柱和 Venusil® XBP C18(L) 液相色谱柱可以用于食品中 的合成着色剂的检测,该方法快速、准确。Cleanert® PWAX SPE 小柱可同时处理9种着色剂,Cleanert® PA 聚酰胺柱可 同时处理 8 种着色剂。
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