【飞诺美色谱】ADC药物的DAR值分析——反相色谱法

艾杰尔飞诺美

2024/09/04 13:47

概述

小分子毒素抗体比DAR（drug-to-antibody ratio）是ADC药物独特的重要质量属性，它代表抗体偶联小分子毒性药物的平均数量。

DAR值分析常见的模式为HIC，该模式下根据分子疏水性逐渐增加的顺序洗脱。荷载小分子药物最多的分子由于疏水性最强最后洗脱，分离过程类似于反相色谱，但是随着ADC药物的payload不断发展，近期科研工作者发现对于偶联较强亲水性payload的ADC药物而言，不同荷载分子之间的疏水性差异不是特别明显，HIC模式下无法很好的分离不同载药数量的ADC分子。

此时反相色谱在就成为一种适合的替代方案，该方法特别适合基于半胱氨酸偶联的ADC。通过对ADC药物进行还原，使抗体还原为轻链和重链，含不同数量小分子载药数的轻链和重链依据载药数量从少到多依次洗脱。再通过计算各轻、重链的峰面积百分比，并结合每个峰偶联小分子药物的个数，计算加权平均DAR值。

Trastuzumab deruxtecan（DS-8201；ENHERTU®) 是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型HER2靶向 ADC。Deruxtecan是毒性药物DX-8951 的衍生物 (Dxd) 和连接子马来酰亚胺-GGFG 肽的偶联物，是一种较为亲水性的payload。

本应用使用Biozen 的400A孔径的WidePore C4色谱柱对 DTT还原后的Trastuzumab- deruxtecan供试品进行分析，并计算其平均DAR值。

关键词

平均DAR值；DS-8201；反相；Biozen WidePore C4； BioTi；核壳柱

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000高效液相色谱仪

3.1.2试剂材料

三氟乙酸，乙腈为色谱纯，屈臣氏蒸馏水

3.1.3样品

Trastuzumab- deruxtecan对照品购自第一三共， DAR值为8。用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;

Trastuzumab- deruxtecan供试品，由客户慷慨赠送，先用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;再用 1M DTT还原后上样。

Trastuzumab购自MCE；先用纯水稀释为浓度为1.0 mg/mL;再用1M DTT还原后上样。

3.2色谱条件

色谱柱：Biozen WidePore C4（2.6um，400A 150*4.6mm）；P/N: 00F-4786-E0；

流动相A：0.1%TFA水；

流动相B：0.1%TFA乙腈；

流速：0.5 mL/min；

柱温：60 ℃；

波长：280nm；

进样量：10 μL

梯度程序见表2：

3.3结果与讨论

通过对Trastuzumab- deruxtecan供试品，Trastuzumab单抗和Trastuzumab- deruxtecan对照品进行还原（100ug蛋白中加入5uL 1M DTT，37°C分别孵育半小时和一小时），我们可以在反相色谱上通过梯度优化，清晰的分离轻链和重链以及荷载不同小分子数量的轻重链。

结论

在本应用使用Biozen 的400A孔径的WidePore C4色谱柱对 DTT还原后的Trastuzumab- deruxtecan 供试品进行DAR值分析。该柱采用核壳技术结合丁基的键合相，可以大幅减少蛋白与固定相的次级作用，改善蛋白回收率，峰形和残留的问题，三键键合技术的C4固定相能够耐受90度的高温；Bio Ti生物惰性的钛合金柱硬件也最大程度的减少了对生物基质样品的干扰，保证分析结果的稳健可靠。

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