high resolution melting HRM 采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线进行突变体等位基因的偏向性扩增

采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线进行突变体等位基因的偏向性扩增 简介： 高分辨率熔解曲线可以通过扫描PCR的扩增片断来检测杂合体中基因序列的变化。该方法在检测小于400bp的PCR片断时灵敏度可达99%以上。该方法自开发以来，被不断的应用于新的领域，如采用小片段扩增法和非标记的探针（LunaProbes）对已知序列进行基因分型。 最近，一种基于快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线分析，进行突变体等位基因的偏向性扩增的方法被开发的了出来。该方法可以在野生型等位基因的背景下检测出突变率小于5%的等位基因的突变。 原理： 采用双链DNA的饱和燃料LCGreen Plus和非标记的探针（LunaProbes）熔解温度的不同（Tm值）来区分不同的基因型。 根据要分析的等位基因，设计出一种可以与之结合的非标记的探针（LunaProbes）。该探针的3’ 端被封闭，以防止PCR过程中的扩增。突变的等位基因的偏向性扩增主要是通过设定PCR反应的退火温度来实现的。这种温度介于完全互补的探针（野生型位点）Tm值和非完全互补的探针（突变体的位点）Tm值之间。在该退火温度下，完全互补的探针和目标DNA链仍然结合在一起，因而抑制野生型序列的PCR反应，从而实现突变体等位基因的偏向性扩增。 示例： LunaProbes与野生型基因之间的Tm值为62ºC，与突变体基因之间的Tm值为54ºC，因而采用58ºC作为退火温度来进行突变的等位基因的偏向性扩增。 图 1. LunaProbes的标准化差异峰. 野生型的等位基因位点（灰色）= 62ºC突变型的等位基因位点（红色）= 54ºC。58ºC作为退火温度来进行50–50的混合样品（黄色）的突变等位基因的差异性扩增。这种扩增方法使得差异扩增的分辨率达到10倍，并且使得检测的灵敏性到0.7–1.5%