Western Blot(WB)蛋白印迹实验在蛋白质分析中发挥着至关重要的作用,然而,对于许多新手研究人员来说,这个过程可能显得复杂且难以理解。
为了帮助初学者快速上手并成功实施WB实验,我们整理了从样本制备到蛋白质检测的每一个步骤以及相应的注意事项,另有实验进阶、疑难排查等相关内容陆续上线,敬请关注!
WB实验原理
WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应,通过变性胶SDS-PAGE将不同分子量的蛋白质分离开,然后转移到固相载体PVDF膜上,再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。
待靶蛋白和抗体充分结合后,用TBST洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗,加入带有HRP标记的对应二抗,这样,我们的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物,加以化学发光液,有靶蛋白的位置就会产生荧光,利用胶片或者化学发光成像仪就可显现靶蛋白的条带。
WB实验步骤及注意事项
01
样本制备
使用机械或化学方法提取生物样本中的蛋白质, 定量总蛋白,样品与缓冲液混合,然后在凝胶上进行电泳。
注意事项:
1. 蛋白质在样品处理过程应在低温下进行,以避免细胞 破碎释放出的各种酶类的修饰(加入合适的蛋白酶抑制剂)。
2. 样品建议分装成合适的量(比如分装出 20μL 检测蛋白质定量用),然后 -20°或 -80℃中长期保存,注意不要反复冻融,因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
3. 切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。
02
SDS- PAGE电泳
蛋白样品被装载到凝胶上,通过电泳将它们按大小分开。
注意事项:
1. 配胶试剂里面的 AP 需要根据实验室实际温度来适量的增加或者减少,比如夏天温度较高, 自然凝胶速度较快,AP 的量需要适当的减少;冬天温度低,凝胶慢,需要适量的增加。
2. 灌胶时掌握好速度,避免气泡产生(注意浓度越小的胶含水越多,凝固后胶体积缩小越多)。加水液封时速度要很慢,否则胶会被冲变形。
3. 所有的蛋白样品定量一致,体积一致,不够的用裂解液补足,样品两侧的泳道用等体积 的1×Loading Buffer 上样,Marker也用1×Loading Buffer调制与样品等体积,这样可以避免出现误差。
4. 电泳时间和电压说法各异。一般电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。
03
蛋白转膜
将蛋白从凝胶基质移动到合成膜支持物上,并与膜相结合,形成印迹。
注意事项:
1. 选择合适的膜和缓冲液是确保蛋白转印成功的关键。必须通盘考虑蛋白质的大小和电荷、转印方法和膜的结合特性。
2. 切滤纸和膜时一定要戴干净手套,因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1min~2min。
3. 用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动,除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡,因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。
4. 用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干。这一步很重要,宁可太干也不能太湿,太干容易烧胡,太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路,大大降低转移效率。
04
封闭
对转印后的膜进行封闭,阻断膜上未结合位点,以防止与抗体的非特异性结合。
注意事项:
做磷酸化蛋白的western时使用BSA(牛血清蛋白)作为封闭液。奶粉含有酪蛋白(一种磷酸化蛋白),如果用奶粉,有可能出现背景深的现象。并且脱脂奶粉含磷酸酶,磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白时会受到影响。
05
抗体孵育
膜首先与一种特异性针对目标蛋白上一个抗原表位的初级抗体孵育。经过几次洗涤后,随后会与一个标记的二级抗体孵育,以提供检测的手段。
注意事项:
1. 为减少非特异结合,可选用封闭液作为一抗和二抗的抗体稀释液。
2. 一抗孵育条件推荐 4°C过夜, 二抗孵育条件为室温,1h。
3. 洗涤液推荐选用 TBST 缓冲液。洗涤时应保持适中的摇床速度,避免过快导致膜上的蛋白 或抗体脱落,同时确保洗涤液能够充分接触到膜上的每一个角落。在洗涤过程中,适时更换新的洗涤液以确保洗涤效果。
4. 洗涤过程中需要保持膜的湿润,避免膜干燥导致抗体结合力下降或蛋白变性。
06
发光显影
将膜清洗以移除未结合的抗体后,使用二抗上的标签来可视化感兴趣的蛋白。抗体可以标记有产生颜色和光的酶,或者直接用荧光标记来可视化蛋白。
注意事项:
1. 采用暗室胶片曝光方法,操作需要尽量熟练,除了要把握曝光时间,还要避免位移(压片、取片过程中胶片和杂交膜不能有移动);保留好胶片,作为原始凭证;
2. 使用化学发光成像仪采集图像,注意采集白光下的图像,并与发光的图像进行融合,作为原始凭证保存。
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