2.保留时间问题
可能致因 | 预防措施/解决方案 |
减少保留时间 | |
键合固定相的损失 (流失) |
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固定相上的(存在)活性基团 |
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增加流量 (流速) |
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柱超载 (色谱柱过载) |
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延长保留时间 | |
改变流动相的成分 |
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键合固定相的损失 (流失) |
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减少流量 (流速) |
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流动相中存在气泡 |
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波动保留时间 | |
柱平衡(色谱柱平衡时间)不足 |
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流动相成分的变化 |
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缓冲能力不足 |
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波动柱的温度 (柱温波动) |
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2. 保留变量(时间变动)
如果所有峰(色谱峰)的保留时间均发生了变化,其致因很可能是如下因素发生了变化:流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速。
如果等度或梯度流动相在在线式混合中出现错误,也可能导致保留时间出现问题。
下面将简要介绍这些问题来源(对上述每个原因都简述如下)。
2.1.如果操作人员操作不当,则会导致流动相组成的意外变化,例如使用在线式混合系统时,流动相混合物(系统)设置不正确;或替换新批次流动相时,未妥善制备新的流动相(新流动相配制不正确)。
在极少数情况下,会出现流动相组分选择性损失的情况,例如蒸发。
当流动相发生变化时,峰形(色谱峰)通常会向相同的方向移动,以缩短或延长保留时间(保留时间变长或变短);而相对保留(选择性因子,a)通常会发生变化。
检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查(复查)系统设置;如有必要,应制备新的流动相。
方法文件应包含特定流动相变化影响的相关信息。例如,有机溶剂或pH值的微小变化会对色谱图产生特征(在色谱图体现出特征性的)影响,如分辨率或保留的变化(分离度的变化或保留时间的漂移)。
如果您怀疑设备出现故障,请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统,然后再次运行。
如果问题依然存在,则问题在于流动相或色谱柱;如果问题不再出现,则可能与其他系统组件或参数相关。
2.2.色谱柱化学(化学性质)变化会在色谱柱的整个生命周期内出现,并且一般会在数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化(漂移)(更长或更短)以及更多的峰拖尾。
更换新柱以确定是否是柱老化导致的问题(可确证色谱柱老化)。
500-2000次注射(进样)的柱寿命是较为理想的;在这一点上,柱成本相较于整体分析,是十分微小的,所以更换新柱的可行性较高(色谱柱在整个分析的成本中所占比例低,因而可以合理更换色谱柱)。
如果色谱柱的使用寿命过短,应仔细检查操作条件,以确保它们适用于该色谱柱。
图5显示了在极端操作条件下,色谱柱寿命较短的示例(缩短的寿命)。
2.3.色谱柱温度变化会导致保留时间的变化:每1°C的温度变化会引起1-3%的保留时间变化。如果不使用柱温箱(即“室温”条件),由于实验室温度的变化,温度通常会在日间(和夜间)循环(周期性)变化。
虽然在室内恒温器的测量下,实验室温度显示为恒定,但是HPLC系统的微观(微)环境可能会发生显著变化,尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时,温度变化极为明显。
使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题,且HPLC系统应远离通风口放置。
2.4.流量(流速)问题可能是因存在气泡、泄漏或泵问题(故障)导致的。
气泡问题应和低压(或脉动压力)以及保留时间的增加相关(可能伴有柱压过低或柱压波动,且保留时间延长)。
对于双头泵,如果只有一个泵头存在气泡,则流量和压力可能会发生脉动(跳动)。
应对流动相进行脱气,然后打开放气阀清空泵,并向泵中多次加入5-10mL的流动相,以正常流速流经泵,从而排出气泡(打开排气阀以正常流速的几倍泵入5-10ml流动相经过泵,以排出气泡)。
在某些情况下,可能需要使用低粘度的脱气溶剂,如甲醇(MeOH)或乙腈(ACN)来清除泵中顽固的气泡。
泄漏也会延长保留时间。配件(接头)上的滴水配件或玻璃体内的结晶沉淀都是泄漏的证据(查看接头如有液滴或结晶析出,可证明有泄露)。
请特别注意色谱柱上游的配件(之前的接头)。
自动进样器内的配件和密封件(接头和密封圈)可能难以检测,可借助手电筒和小镜子进行检查。
如果使用不锈钢配件,通常1/4的紧固螺母(将接头螺好再拧紧1/4圈)便可以阻止泄漏。
使用PEEK配件(接头)时,应停止泵,松开接头,将管子推到配件(接口)端口的底部,然后在重新启动泵之前拧紧配件(接头)。
拧紧PEEK配件(接头)时如果存在流动的液体,会导致管道在配件中滑动,产生柱外死体积,进而影响分离效果。
存在缺陷的止回阀(单向阀)或磨损的泵密封件(圈)会导致流量偏低或波动。
止回阀(单向阀)出现问题将导致压力的波动。如果在清除泵中气泡后还无法改善压力波动的情况,则止回阀(单向阀)可能存在故障。
可以更换新的止回阀(单向阀);也可以将止回阀(单向阀)放置在(装有)MeOH的烧杯中,对其进行超声处理,以实现有效的清洁。
如果无法有效区分入口端和出口端之间的止回阀(如不易分清入口单向阀和出口单向阀),请划线标记或用标签标记烧杯。将每个止回阀(单向阀)放入单独的烧杯中进行清洁,使其分开清洁。如果部件滑出,应小心组装,以免受到污染(无尘手套,避免划伤部件等)。
随着使用时间的增加,泵密封件(圈)会出现磨损;而且使用缓冲流动相或将其置于高盐条件下(例如离子交换法),会缩短它的使用寿命。
您可以建立一个预防性维护计划,定期更换密封件并做相应记录(准确记录更换密封圈的时间间隔,就可以建立预防性的维护计划),从而在故障发生前更换密封件。如果无其它指标(征兆),应至少每年更换一次密封件(圈)。
2.5.比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果(使梯度洗脱效果变差)。
图6示例显示了两次连续注射肽样品的梯度洗脱分析。在这种情况下,系统适用性测试允许两次运行之间存在0.1分钟的变化(保留时间变化);第一个峰值不符合该标准,最后一个峰值勉强通过而中间两个峰值明显超出规定值。
图6. 两个连续梯度运行的(两次连续梯度洗脱)色谱图显示了梯度中点附近的峰形具有较大的误差(保留时间的误差较大)(13分钟)。来源[3]。
下面介绍了一种检查流动相配比(混合)精度的简单方法。
将柱更换为0.005英寸直径约1米长(0.12mm)的管道(取下色谱柱,换上长约1米,内径0.005英寸(0.12mm)的管路),在A容器中加水,且B容器中放有含有0.1%丙酮的水,将检测器波长设置为265nm,并使用足够高的流速使止回阀(单向阀)能够有效工作(例如2mL/min)。
以10%为增量运行一系列梯级(梯级实验)(10%、20%、30%……90%、100%B)。
由于问题经常出现在50%B附近,所以在45%B和55%B处增添了额外的梯级。
其结果应是平滑的阶梯状(参见图8a)。
对于图6的样品,在40%-60%B的梯级中观察到图7的曲线。
梯级是扭曲的(已变形),且45%到50%B的梯级(梯级变化)是8.4%而不是5%。
图7中的虚线近似于(拟合了该)梯度,同时(在)45%和50%B之间存在偏移。
因此,此处应是由具有较大保留变量的峰被洗脱导致的(不幸的是,这正是那些保留时间偏差较大的峰出峰的位置)。
HPLC系统可对比例阀进行调节。
当执行此操作时,梯级会变得平滑且保留时间也会处于规格范围之内。
图7. 在图6的梯度中点附近执行配比(比例)阶梯测试的结果。理论值显示在括号内。来源[3]。
如果系统性能良好,其阶梯测试的结果应与图8a类似,在整个图中呈现阶梯状。
未注射的0-100%B梯度是应运行的对比测试(另需同时进行一无进样的0-100%B梯度试验)。
它应显示为线性基线、线性梯度部分和线性后期梯度保持,每个部分之间均是平滑的曲线过渡(线性梯度部分以及一段梯度升高后维持直线,每两段之间为平滑曲线过度)。
图9的示例显示了在约25%、50%和75%B的线性(箭头)条件下,空白梯度运行呈现有规律的偏移。
图8. 图9显示了HPLC系统的梯度阶梯测试结果。(a)0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100%B的梯级;(b)以1%的梯级向上跟踪至45-55%。箭头显示了50和51%之间的“较短”梯级。来源[4]。
与这些条件相对应的阶梯测试如图8a所示,并且在这个度量(放大比例)下表现良好。
为了更仔细地检查问题区域,在45-55%B范围内以1%的增量进行阶梯测试,如图8b所示。
这个扩展(放大)图清楚地显示了在50%和51%之间的梯级中,存在不规则性。
在线性图中的定期(有规律间隔的)误差(图9)表明,控制比例阀的算法或比例阀本身存在问题。
在目前的情况下,调整控制(控制软件)软件无法解决问题,因此应更换比例阀,以解决问题(因此更换了比例阀,问题被解决)。
图9. 故障比例阀线性梯度图。箭头显示线性偏离;绘制下面的虚线以供参考(虚线为标准参考线)。以1mL/min的速度运行梯度0-100%B 15分钟;A =水、B = 0.1%丙酮水溶液;检测UV 265nm。来源[4]。
尽管可以假设单一来源是导致特定HPLC问题的原因(虽然通常可以假定某HPLC问题只有一个故障原因),但情况并非总是如此。
图10a显示了以非常浅的梯度(30分钟内19-24%ACN)连续三次注射肽样品的结果(显示了一种多肽样品三次连续进样,窄梯度洗脱(30分钟内19-24%乙腈梯度洗脱))。
由于怀疑存在流量(流速)问题,因此在双活塞双泵系统中更换了所有8个止回阀(单向阀)和4个泵密封件(圈)。
这大大改善了保留变量(保留时间大为改善),保留范围从2.1分钟变化到1.0分钟(图10b),但仍然是(此偏差仍)不可接受的。
为了进一步研究问题,将溶剂预混合到装有15% ACN的A容器和装有25%ACN的B容器中(在A瓶中预混合15% 乙腈,在B瓶中预混合25% 乙腈)。
当调整仪器设置以产生与图10a和b相同的梯度时,获得图10c所示的结果。尽管仪器的配比精度在±0.1%的规格范围内,但对于非常浅(窄)的梯度来说仍是不够的。
预混合溶剂将有效精度从0.1%提高至0.01%,如果该样品希望具有令人满意的保留时间再现性,这点是必需的。
预混合可以提高系统性能,以满足苛刻的分离要求。
图10.三次连续注射肽样品的扩充(放大)色谱图。产生的色谱图:(a)使用原始系统配置(b)更换所有止回阀(单向阀)和泵密封件(圈)后(c)使用预混流动相。色谱柱:250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃运行,并在215nm检测。梯度:30分钟内19-24%ACN / 0.1%TFA的水溶液。来源[5]。
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