?如何应用显微切割技术分离单个染色体

天津徕科光学仪器有限公司

2017/03/29 13:36

如何应用显微切割技术分离单个染色体

在巴西的centro de energia nuclear na agricultura/usp (cena)开展的第一届leica研习班上，参与者们学习如何在冰冻切片机上应用显微切割技术（lmd）制备样本。而另一个主题是从分散的染色体中分割单个染色体。经过一系列培训之后，激光显微切割的新用户们学会了如何运行系统，如何切割染色体并收集单个染色体以进行后续的分析。

使用冰冻切片机为激光显微切割制备样品
激光显微切割的样本准备比普通显微镜更需要技巧：组织需要防止降解和变性，此外已经使用过的固定剂和染液不应该影响后续实验分析。因此如果要进行rna下游分析，首选新鲜的冰冻切片组织：新鲜的材料为固定提供了最高的起始质量和特殊的实验设计。上游的染色程序保证高质量的rna，并且激光显微切割过程也不会对rna质量产生影响。

fig. 1, 2: falk schlaudraff博士，leica显微系统产品经理 (中间, 左边), 解释如何在冰冻切片机上用新鲜的冰冻组织为激光显微切割做样本准备。

为激光显微切割进行分散染色体制样
除了为rna的后续分析做组织准备和切割以外，研究者也经常需要进行dna分析（例如检测突变）。由于单个细胞普遍拥有两对染色体，所以单个染色体的分离对于研究染色体特异性疾病和了解不同物种的基因结构和功能来说非常重要。

使用leica激光显微切割系统，并结合150倍干物镜与pol框形载片，可以非常容易的分离单个染色体。步骤1：在pol框形载片上制备分散染色体样本。下面的leica激光显微切割实验步骤指南中，以人血液白细胞为例，介绍这类样品准备的实验步骤
由henry dijkman博士慷慨提供，department of pathology, radboud university nijmegen medical center,the netherlands

用于激光显微切割的分散染色体制样的实验步骤：
1. 细胞培养72至96个小时。
2. 秋水仙胺（colcemid）处理1小时。
3. 低渗溶液处理10至12分钟。
4. 细胞漂洗和固定：甲醇/醋酸 (3 + 1, v/v).
5. 将固定细胞滴在pol框形载片上，过夜干燥。
6. 吉姆萨染液处理3分钟。
7. 再次用水漂洗后，在空气中干燥。
8. 将载玻片放置在leica lmd系统的载物台上，用低倍镜观察确定分散染色体的位置。
9. 切换到150倍干物镜，获得分散染色体更精细的图像。
10. 清除目的染色体周围区域（使用move+cut或者draw+scan模式）。
11. 为目的染色体切割选择收集装置，激光参数设定，并进行切割分离。

这个短视频展示了一位新使用者在leica专家的指导下练习如何分离染色体。

收集完单个染色体后，分析和扩增如此微量的原材料并不容易。商品化的试剂盒，例如qiagen repli-g kit ，可以帮助研究者更有效的完成工作。“我们的实验过程证明收集染色体变得十分容易，”falk说到，“并且操作leica lmd系统是个十分有趣的过程。”

fig. 3:研习班上的实际操作.用户们在简短的介绍后很流畅的操作系统。

leica lmd激光显微切割系统连接了显微镜和分子生物学。“当你发现系统的正确设置后，你就可以去操作了。”falk解释道，“这值得投入时间去摸索适合你自己样本的最佳设置，加以保存并且在实验中直接恢复设置，将会节约大量的操作时间！”

fig. 4: 除了实际操作，也针对lmd一些应用技术上进行了提问和回答。

fig. 5: 第一届lmd研习班的参加者

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