全自动固相萃取-高效液相色谱法测定油中黄曲霉毒素B1

睿科集团股份有限公司

2024/07/31 10:18

黄曲霉素已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有二十多种，包括B₁、B₂、G₁、G₂、M₁等毒素和毒醇，存在于土壤、动植物等中。它属于一类致癌物，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。黄曲霉毒素主要污染粮油及其制品，各种植物性与动物性食品也能被污染。产毒素的黄曲霉菌很容易在水分含量较高（水分含量低于12%则不能繁殖）的禾谷类作物、油料作物籽实及其加工副产品中寄生繁殖和产生毒素，使其发霉变质，人们通过误食这些食品或其加工副产品，又经消化道吸收毒素进入人体而中毒。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，黄曲霉毒素在1类致癌物清单。

本文参考GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》第三法进行前处理，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱测定，建立了油脂样品中黄曲霉毒素B₁的检测方法。在2.0ng/L的加标水平下，黄曲霉毒素B1的加标回收率在88%-97%之间，RSD值小于5%，说明本方法可以满足油脂样品中黄曲霉毒素B₁的测定。

仪器与耗材

1.1仪器

睿科集团V20垂直振荡器

睿科集团Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪

睿科集团Auto EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪

高效液相色谱仪：Agilent 1260高效液相色谱仪，配有荧光检测器

1.2耗材和试剂

耗材

黄曲霉毒素B₁免疫亲和柱，3ml-20支/盒，300ng（货号：HC-QHZ-0001）

试剂

纯溶剂：乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（分析纯）

甲醇水溶液（70+30）：取甲醇700mL加入300mL水中混合均匀

实验流程

样品制备：称取5g油样（精确到0.01g）于50mL离心管中，加入20mL提取液（甲醇：水=7：3），使用V20垂直振荡器振荡提取5分钟。然后以6000rpm的转速离心5min，取4mL上清液50mL离心管中，加入23mL0.1%吐温-20的PBS缓冲溶液稀释混匀，待净化。

净化：取全部备用液过柱，用20mL水进行淋洗，用2mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液于试管中。

浓缩：洗脱液用Auto EVA 80 高通量全自动平行浓缩仪在50℃下氮吹至近干，再加1mL初始流动相复溶，涡旋混匀，过0.22µm微孔滤膜，供高效液相色谱测定。

固相萃取方法

图1：黄曲霉毒素B₁萃取方法

检测条件

表-1：高效液相检测条件

色谱柱	C18柱(2.1×100 mm,1.7 um)
柱温	40 °C
流速	0.3 mL/min
进样量	10 µL
流动相	水：甲醇+乙腈（1：1）=65%：35%等梯度洗脱
荧光检测器	激发波长365nm，发射波长436nm

结果与讨论

为了验证该方法的回收率，本实验向0.4g油样中加入黄曲霉毒素B₁标准品进行加标回收验证(添加浓度2ng/L，n=3)，数据如表-2所示。加标回收率在88%-97%之间，RSD值控制在5%以内。说明该方法能够很好地运用于油样中黄曲霉毒素B₁的测定。

表-2.油脂样品黄曲霉毒素B₁加标回收率及RSD值（n=3）

序号	化合物	回收率（%）样品1	回收率（%）样品2	回收率（%）样品3	平均回收率(%)	RSD(%)

1	黄曲霉毒素B₁	88.05	96.84	91.43	90.2	4.81