方案摘要
方案下载| 应用领域 | 生物产业 |
| 检测样本 | 其他 |
| 检测项目 | |
| 参考标准 | 冠醚类衍生物 |
在本应用案例中，样品为合成反应获得的苯并 冠醚衍生物，该样品体系复杂，包含多种不同极性的 组分，利用常规二元溶剂梯度进行纯化时很难获得良 好的分离度。针对样品的具体性质，三泰科技的应用 工程师利用四元溶剂系统SepaBean machine T配合 SepaFlash 正相硅胶柱，通过不同极性溶剂的在线切 换，成功对样品进行了制备纯化，获得了满足制备需 求的目标产物，为此类组分极性差异很大的复杂样品体系的分离纯化提供了一种可行的方案。
实验部分
本文中待纯化的样品来自某高校实验室，为合成的苯并冠醚衍生物类分子，其分子结构式示意图请参见图1。样品体系复杂，各组分极性差异很大，样品在弱极性有机溶剂中溶解度不佳，必须采用二氯甲烷作为溶剂才能完全溶解。
图1. 苯并冠醚衍生物类样品分子结构式示意图。
取4.9 g固体样品粉末溶于少量二氯甲烷中，利用适量硅胶（200~400目）进行拌样后将溶剂旋蒸处理干净，取少量样品经一根4g SepaFlash iLOK空柱（订货号：SD-0000-004）进行固体上样。样品的Flash分离纯化实验参数如表1所示。
表1. Flash制备纯化实验参数设置。
仪器 | SepaBean® machine T | ||||
色谱柱 | 12 g SepaFlash® 正相分离柱 (无定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号：S-5101-0012) | 25 g SepaFlash® 正相分离柱 (无定形硅胶, 40 - 63 μm, 60 Å, 订货号：S-5101-0025) | |||
检测波长 | 254 nm, 280 nm | ||||
流动相 | 溶剂A：二氯甲烷； 溶剂B：甲醇 | 溶剂A：正己烷；溶剂B：乙酸乙酯 溶剂C：二氯甲烷；溶剂D：甲醇 | |||
流速 | 25 mL/min | 30 mL/min | |||
进样量 | 500 mg (约含有250 mg样品) | 3.0 g (约含有1.5g样品) | |||
洗脱梯度 | 时间 (CV) | 溶剂B (%) | 时间 (CV) | 溶剂B (%) | 溶剂D (%) |
0 | 0 | 0 | 0 | / | |
4.0 | 0 | 3.0 | 0 | / | |
13.5 | 10 | 6.0 | 16 | / | |
19.0 | 10 | 10.0 | 16 | / | |
23.5 | 16 | 20.0 | 50 | / | |
23.8 | 100 | 30.0 | 50 | / | |
28 | 100 | 44.0 | 80 | / | |
44.5 | 100 | / | |||
63.0 | 100 | / | |||
63.1 | / | 0 | |||
85.0 | / | 4.0 | |||
110 | / | 4.0 | |||
结果与讨论
考虑到样品的性质，我们首先利用常规的二元溶剂体系二氯甲烷/甲醇作为流动相，对上样后的分离柱进行洗脱，样品在此条件下的Flash制备图谱如图2所示。
图2. 样品在二元溶剂体系下的Flash分离图谱。
分析图2可知，以二氯甲烷/甲醇体系作为流动相时，样品可以在正相硅胶柱上获得足够的保留时间，但是其中的组分没有获得有效分离。分析样品的合成路径，参考经典的二苯并18-冠-6的合成路线（如图3所示），可知此类样品体系中除了非极性（亲脂性很强）的目标产物外，还含有过量或未反应完全的强极性原料（如邻苯二酚）或其他副产物，因此样品体系中含有多种不同极性的组分。当采用简单的二元溶剂梯度时，由于二氯甲烷/甲醇体系适用于极性较强的组分，对于弱极性组分的选择性就不如正己烷/乙酸乙酯这样的溶剂体系。因此，对于含有从弱极性组分到强极性组分的复杂样品体系，作为对简单二元溶剂系统的改进，选取不同选择性的二元溶剂系统对色谱柱进行连续洗脱，可以获得对复杂样品体系中各组分更好的分离度。
图3. 二苯并18-冠-6的合成路线图。
参考Snyder溶剂选择性三角形（如图4所示），依据其不同的酸性、碱性及偶极性质，常用溶剂可以大致分为8组，每组溶剂在这个三角形中各自占据一定位置。根据相似相容原理，不同组别的溶剂对样品具有不同的选择性。因此，通过优化溶剂组合，可以获得对样品更佳的选择性，从而优化样品分离效果。
图4. Snyder溶剂选择性三角形示意图。
回到之前实验条件中选择的常规二元溶剂体系：二氯甲烷/甲醇体系，查询溶剂极性参数表（参见表2），可知二氯甲烷和甲醇的极性参数P’分别为3.1和5.1，而正相分离中常用的正己烷和乙酸乙酯的极性参数P’分别为0.1和4.4，对比这两种常用的正相溶剂体系可知，对于组分极性分布范围较大的复杂样品体系，若能同时采用这两种溶剂体系进行连续洗脱，将获得对样品中各组分最佳的分离度。
表2. 常用溶剂的极性参数P’。
溶剂 | P’ | 溶剂 | P’ | 溶剂 | P’ |
正戊烷 | 0.0 | 正丙醇 | 4.0 | 丙酮 | 5.1 |
正己烷 | 0.1 | 四氢呋喃 | 4.0 | 甲醇 | 5.1 |
苯 | 2.7 | 氯仿 | 4.1 | 乙腈 | 5.8 |
乙醚 | 2.8 | 乙醇 | 4.3 | 乙酸 | 6.0 |
二氯甲烷 | 3.1 | 乙酸乙酯 | 4.4 | 水 | 10.2 |
常规配置二元溶剂系统的Flash制备色谱仪通过一台系统泵配合二元比例阀产生流动相梯度，这种配置的仪器在进行需要同时更换两种溶剂的连续梯度洗脱时，就必须将Flash柱从仪器上取下，然后利用后续待使用的新溶剂冲洗管路，再次装上Flash柱后进行后续分离实验。这些操作无疑增加了实验人员的工作量，降低了实验效率。SepaBean machine T采用四元比例阀系统，可以从四路溶剂中任意选择两种作为流动相进行梯度洗脱，因此使得实验中在不同流动相体系之间连续在线切换成为了可能。在接下来的实验中，我们选择了正己烷/乙酸乙酯过渡至二氯甲烷/甲醇体系，对样品进行了连续洗脱，Flash制备纯化实验参数设置参见表1，样品在此条件下的Flash制备图谱如图5所示。
图5. 样品在四元元溶剂体系下的Flash分离图谱。
分析图5可知，在Flash分离实验第一阶段，采用正己烷/乙酸乙酯体系作为洗脱溶剂，首先将样品中极性较弱的组分从Flash柱上洗脱下来；在第二阶段，采用二氯甲烷/甲醇体系作为洗脱溶剂，可以进一步将样品中极性较强的组分从Flash柱上洗脱下来，从而使得样品中不同极性的各组分分别得到有效分离和收集。对收集组分进行TLC点板确认，采用0.5%高锰酸钾溶液作为显色剂，利用热风枪对TLC板烘烤5min后，粗品及收集组分的显色结果如图6所示，确认各组分已得到有效分离，可以应用于下一步的研究开发中。
图6. 粗品及收集组分的TLC点板实验结果。
结论
对于苯并冠醚衍生物类复杂样品体系，由于其中组分极性分布范围广，常规二元溶剂体系很难对样品中各组分获得良好的分离度，利用四元溶剂系统SepaBean machine T ，对不同极性的洗脱溶剂体系进行连续在线切换，最终获得了更好的纯化效果，为此类复杂样品体系的制备纯化提供了一种便捷高效的解决方案。
如需进一步了解SepaBean machine的详细规格信息，或配套使用的Flash纯化柱订购信息，请访问ChemBeanGo在线商店：https://store.chembeango.com/。
文献贡献者
SepaFlash® Phenyl 色谱柱在苯二氮卓类药物化合物的分离纯化
应用于糖类化合物的分离纯化
应用于含硼有机光电材料领域分离纯化
相关产品
SepaBean machine 2快速制备液相色谱
SepaBean machine U200快速制备液相色谱
SepaBean machine U100快速制备液相色谱
SepaBean machine快速液相制备色谱
SepaBean machine T快速液相制备色谱
SepaBean machine 2快速液相制备色谱系统V2.0
SepaBean machine T快速液相制备色谱系统 V2.0
SepaBean machine U200快速液相制备色谱系统 V2.0
SepaBean machine U100快速液相制备色谱系统 V2.0
SepaBean machine 快速液相制备色谱系统 V2.0
三泰E系列SepaFlash快速液相制备色谱柱
三泰 超大内径分离柱 制备柱全新升级
三泰 超大内径分离柱 Silica柱
高效系列 SepaFlash快速液相制备色谱柱
键合相系列 SepaFlash快速液相制备色谱柱
关注
拨打电话
留言咨询
