Hello!小G终于和大家见面啦!从今天起,小G每周将分享一些实验技巧,旨在解决大家在实验过程中遇到的各种问题。
在很多情况下,我们辛辛苦苦表达的蛋白往往是不可溶的,并积聚在一种叫“包涵体”的物质当中。这种情况在高表达量的条件下尤为明显。
今天,小G就介绍一些方法,可以有效地提高蛋白的可溶性。
1:降低蛋白合成速率
既然高表达量容易导致不可溶蛋白的形成和积聚,那么只要降低蛋白合成速率,就有很大几率提高蛋白质折叠的正确率。其中包括:
a) 降低培养温度(这个方法可以有效的减缓蛋白合成/折叠的速率,通常可以获得多一些的可溶性蛋白);
b) 尝试更弱的启动子(e.g. trc代替T7);
c) 尝试低拷贝质粒;
d) 降低诱导剂浓度;
2:优化或更换培养基
a) 添加对所表达蛋白正确折叠及稳定性必要的辅助集团或辅助因子;
b) 在表达过程中添加缓冲液来缓解pH的波动;
c) 添加1%的葡萄糖来阻遏乳糖对lac启动子的诱导;
d) 添加适量多元醇(例如山梨醇)和蔗糖
* 这个添加剂可引起细胞渗透压增加导致渗透保护(osmoprotectants)剂在细胞中的积累,而渗透保护剂有助于蛋白质天然结构的折叠
e) 加入乙醇,低分子量硫醇与二硫化物和NaCl[1]。
3:分子伴侣和/或折叠酶的共表达。
分子伴侣和折叠酶,这两种蛋白质在蛋白质折叠中起着重要作用。其中:
a) 分子伴侣通过与折叠中间体的瞬时相互作用来促进适当的异构化和细胞靶向,促进正确的折叠。其中最佳表征的大肠杆菌系统是:
1. GroES-GroEL
2. DnaK-DnaJ-GrpE
3. ClpB
b) 折叠酶主要加速折叠通路中的限速步骤。其中三种类型的折叠酶起重要作用:
1. 肽基脯氨酰顺/反异构酶(peptidyl prolyl cis/trans isomerases, PPI);
2. 二硫键氧化还原酶 (disulfide oxidoreductase, DsbA) 和二硫键异构酶(disulfide isomerase, DsbC);
3. 蛋白二硫键异构酶(protein disulfide isomerase, PDI)。
* 一种催化蛋白半胱氨酸氧化和二硫键异构化的真核蛋白,还可以同时展现伴侣活性。
将一种或多种这些蛋白与靶蛋白进行共表达可有效提高靶蛋白的可溶性。不同伴侣/折叠酶的共表达水平必须针对每个实例进行优化。当用作融合伴侣时,DsbA和DsbC也对表达水平显示出积极作用。
那么,除此之外,还有什么方法可以提高我们表达蛋白的可溶性呢?
敬请期待下周四更新的《G课堂 |【Tips】如何提高蛋白可溶性(下)》
参考文献:
[1] Georgiou, G. & Valax, P. Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 7, 190-197
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