找到了一篇相对较老的Cell,以恶性疟原虫为对象,研究细胞间信息的传递,工作量不大,但很精巧!恶性疟原虫要完成其生活史需要人和蚊子两个宿主,在人红细胞内经历滋养体(又称环状体)/裂殖体/配子体几个阶段,文章详细内容如下:
为了研究胞间信息传递,构建了两种恶性疟原虫,都表达绿色荧光蛋白,3D7edhfr对WR耐药,CS2eBsd对Rs耐药,两者单独感染红细胞于WR+Rs培养体系内无法在红细胞内形成环状体,只有混合培养时才能成功感染红细胞,形成环状体,暗示两种虫体之间存在耐药信息的传递
换了“虫子”验证耐药信息的传递:只有耐两种药的“虫子”混合培养才能在WR+Rs培养体系中形成环状体,携带耐药信息的红细胞或质粒均无法在“双药”体系中长出环状体,暗示红细胞或质粒均不足以传递耐药信息
耐药信息发生传递,那荧光蛋白信息呢?两种带不同荧光蛋白的疟原虫共培养后,荧光蛋白出现了共表达,暗示荧光蛋白信息也发生了传递
用荧光原位杂交探针检测耐药基因,发现共培养后耐药基因确实发生了传递,出现了同时表达两种耐药基因的疟原虫
PCR扩增后再次确证:耐药基因和荧光蛋白基因发生了传递
既然发生了信息传递,那么信息传递是否需要两者接触呢?利用trans well隔离培养两种疟原虫,发现耐药信息传递不需要接触,且存在方向性-由CS2eBsd传向3D7edhfr
再次验证传递存在方向性
前面是以环状体形成为指标验证耐药,在核酸层面再次确证发生了耐药信息的传递
将两种疟原虫共培养于上层小室,取分泌到小室外的培养基上清加入到“双药”体系培养3D7edhfr,发现耐一种药的3D7edhfr能够在“双药”体系中存活且扩增能力与加入的混合培养上清体积成正比!这个类似rescue的实验说明耐药信息传递的载体被分泌到了培养上清中
耐药信息是被分泌到培养上清中,且存在方向性,设计了新实验:CS2eBsd于上层小室培养,让其分泌“耐药信息载体”到下层,可见,分泌时间越长,越利于下层疟原虫获得耐药信息进而扩增
将环状体期或裂殖体期的分别耐药的两种疟原虫置于“双药”体系共培养,发现环状体期共培养在双药体系中生长更好,暗示耐药信息是在环状体期发生传递的
分别耐药的两种疟原虫置于上层小室共培养一段时间后移除上层小室,药物刺激组的配养上清更能促进新的疟原虫生长,暗示药物刺激能促进耐药信息载体的分泌
微丝和微管参与细胞的分泌功能调节,使用微丝或微管抑制剂后,两种分别耐药疟原虫共培养的“双药”体系中环状体形成减少,且存在剂量-效应关系,暗示耐药信息载体可能是细胞分泌的囊泡
100kDa的“袋子”能阻碍耐药信息的传递,暗示耐药信息载体大于100kDa
原子力显微镜确实拍到红细胞有“吐泡”,白色箭头是正在“吐”,黑色箭头是已经“吐”出来了,视野较小,不具一般性!
大视野下,设置多组实验发现:混合培养组红细胞的确会分泌更多的“小泡”,加抑制剂后分泌减少,暗示耐药信息载体是这些“小泡”
离心法分离得到培养上清不同组分,发现4号5号促进裂殖体形成能力最强
比较无促进作用的3号和有促进作用的4号,发现4号尺寸在70nm,3号尺寸较小,再结合上面的数据:尺寸70nm的外泌体样囊泡(exsome-like vesicles没有说是外泌体)为耐药信息载体
KO PTP2蛋白后,疟原虫接受耐药信息,环状体形成受到抑制,暗示PTP2蛋白在耐药信息传递过程中起到重要作用
SIM超分辨和电镜看PTP2蛋白定位情况:定位于SBP1标记的Maurer’ s cleft(MC)
KO PTP2后外泌体样囊泡生成减少
环状体阶段接收到的信息传递到了胚子体阶段
“双药”体系共培养组才能高效的发育到配子体阶段
共培养后获得耐药信息的疟原虫发育成配子体的能力强于天然双耐药组(3D7idhfr/Bsd) ,提示胞间信息传递对于疟原虫发育的巨大正向作用
换个方法验证胞间信息传递对于发育的正向作用:流式检测配子体的量
笔者觉得这篇文章最闪光的地方不在于用到了多么高端实验技术,而在于实验设计的巧妙:利用trans well空间分隔能力巧妙的研究了外泌体样囊泡,更进一步,梯度离心拿到不同组分,发现了囊泡尺寸和信息传递功能之间的相关性,王晓东老师当年发现细胞色素C在凋亡中的作用也是这个模式(柱分离接到的不同试管依次验证功能,慢慢纯化,最终发现起效的是细胞色素C的)- 很简单,很平凡……
Regevrudzki N, Wilson D W, Carvalho T G, et al. Cell-Cell Communication between Malaria-Infected Red Blood Cells via Exosome-like Vesicles[J]. Cell, 2013, 153(5):1120.
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