非甾体抗炎药(non -steroid anti- drugs, NSAIDs)是药物性肝损伤最常见的原因。特别是双氯芬酸(Diclofenac)类药物,常用于治疗慢性疼痛和炎症性疾病,2009年FDA就其潜在的肝毒性效应发出警告。
进行肝毒性研究,体内模型实验既昂贵又耗时,而使用原代肝细胞的体外筛选成本更低,且易于进行高通量检测。一项典型的毒性研究在数天内反复给培养的肝细胞加药,以评估累积效应。然而,2D培养条件下的肝细胞很难形成细胞-细胞和细胞-基质通信网络,且2D培养条件将导致原代肝细胞快速去分化和代谢能力降低。这些缺陷限制了目前肝毒性研究的范围,并妨碍对药物在体内累积和长期影响的真正理解。
在本文介绍的研究中,基于BioTek的Cytation高通量细胞成像平台,对比了2D和3D培养条件下Diclofenac对肝细胞的毒性,并证实了Diclofenac肝细胞毒性的作用机制。
3D肝脏微组织的Diclofenac细胞毒性研究结果
如图1所示,在Diclofenac给药剂量范围内,3D肝脏微组织细胞总数相对稳定,而死亡细胞数量在给药期间随着Diclofenac浓度的增大而增加。
图1. 3D培养条件下,Diclofenac肝毒性实验结果。X轴-给药时间,左Y轴-总细胞数和死亡细胞数,右Y轴-细胞死亡率
3D肝脏微组织的成像结果(图2)直接证实了这一点。这表明,在检测化合物的潜在细胞毒性时(尤其是在长期给药评估期间)3D微组织是一个可行的选择。
图2. 3D肝脏微组织细胞毒性成像结果。Diclofenac治疗10天后3D肝微组织的代表性图像,Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞,CellTox Green(绿色)标记死亡细胞,分别使用Cytation的DAPI和GFP成像通道自动捕获。
此外从图1结果可以发现,使用300μM Diclofenac直到第三天才出现明显的细胞毒性。而此前公布的数据显示,200 - 450μM Diclofenac 24小时内即可观察到明显的细胞毒性。这种对比差异强调了使用3D细胞模型进行细胞毒性研究的必要性。
2D肝细胞的Diclofenac细胞毒性研究结果
如图3所示,与对照组相比,Diclofenac浓度最高时的总细胞数和死亡细胞数均降低,细胞死亡率保持不变或低于对照组,这与预期相反。
图3. 2D培养条件下,Diclofenac肝毒性实验结果。X轴-给药时间,左Y轴-总细胞数和死亡细胞数,右Y轴-细胞死亡率
图4成像结果证实,随着Diclofenac浓度增大,越来越多的细胞死亡,并且已经从板底脱落,因此检测到的总细胞数和死亡细胞数均降低。这种现象使得2D细胞培养下的分析变得复杂,进一步支持将3D细胞培养模型纳入长期细胞毒性评估。
图4. 2D培养条件下,肝细胞毒性成像结果。Diclofenac治疗10天后肝细胞的代表性图像,Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞,CellTox Green(绿色)标记死亡细胞,分别使用Cytation的DAPI和GFP成像通道自动捕获。
证实Diclofenac细胞毒性作用机制
在细胞毒性评估的同时,监测线粒体氧化应激和线粒体渗透性转换(Mitochondrial permeability transition,MPT)孔开放情况,以证实Diclofenac肝细胞毒性的作用机制。
如图5所示,随Diclofenac浓度增大,红色荧光信号显著增强,表明超氧化物水平升高。这与之前发表的数据一致,显示Diclofenac的细胞毒性是ROS形成的结果。
图5. Diclofenac给药3天后,线粒体氧化应激评估结果。Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞,MitoSOX Red(红色)标记线粒体超氧化物,分别使用Cytation的DAPI和RFP成像通道自动捕获。
如图6所示,随着Diclofenac浓度增加,绿色荧光信号的显著减弱,表明线粒体氧化应激的增加也导致了MPT孔开放。
图6. Diclofenac给药7天后MPT诱导评估结果。Hoechst 33342(蓝色)标记所有细胞,MitoTracker Red(红色)标记活细胞线粒体,Calcein(绿色)标记细胞内钙离子,分别使用Cytation的DAPI、RFP和GFP成像通道自动捕获。
本研究结果表明:在2D培养条件下,由于肝细胞从微孔板的底部脱落,使细胞计数变得复杂。与传统的2D培养相比,3D微组织对毒素的反应较弱,这表明3D培养的细胞-细胞和细胞-基质通信创造了一个更适合长期监测的细胞培养系统。结合3D细胞培养模型和BioTek的Cytation高通量成像平台,可以快速获取准确可靠的可重复结果。
本文内容涉及的检测仪器:
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