Western blotting是研究蛋白表达最常用的经典技术,常用于检测靶蛋白的丰度、检测蛋白的修饰、蛋白相互作用研究中。常用化学荧光、化学发光和荧光三种方式对结果进行成像和定量分析。
1)化学荧光:
化学荧光采用ECL Plus底物代替化学发光检测底物ECL检测Western blotting信号,具有灵敏度高、线性范围宽的特点。ECL Plus试剂与HRP标记的二抗反应,反应产物在488nm激光激发下能够产生发射光,发射光通过Cy2滤光片由检测器接受,并转化为电信号。化学荧光可由激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon检测,超大检测面积,可同时检测20张10×8cm印迹膜,
2) 近红外双通道荧光
用近红外荧光标记的二抗取代HRP标记的二抗进行Western blotting检测,在抗体孵育结束后,即可直接利用激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon进行成像,不需要添加ECL底物,不需要在暗室进行X光片曝光,减少了实验步骤,节省时间,也节约了实验成本。
印迹膜在近红外波段具有较低的自发荧光,使得在成像时容易获得极低的背景,保证检测的高灵敏度。同时,近红外荧光具有宽的线性范围,使得定量更准确。通过双近红外荧光标记的二抗,不需要stripping和reprobing即可在同一张膜上同时检测目的蛋白和内参蛋白,实现同一泳道内参蛋白归一化,使定量更准确。同时,双通道检测更便于研究蛋白磷酸化水平。
3)三通道荧光
使用双色荧光标记二抗和一个荧光直接标记的一抗,可以在一张膜上同时检测三个蛋白,如内参蛋白、目的蛋白和磷酸化蛋白。在磷酸化水平的检测中,引入内参蛋白归一化校正不同泳道间的上样量差异,使得实验设计更严谨,所得结果更准确。
4)总蛋白归一化,定量更准确
利用上样的总蛋白含量进行泳道间归一化,避免了内参蛋白选择烦恼。总蛋白归一化可基于荧光染料的蛋白质预标记技术,即在上样前,通过Cy5染料将蛋白标记上红色荧光。电泳结束后直接获得SDS-PAGE电泳图像,无需染色;也可在转印结束后根据膜上Cy5信号强度,判断转印情况;总蛋白信号代替内参蛋白用于归一化处理,结果更准确。
总蛋白归一化与内参蛋白归一化相比具有:更宽的检测范围,更强的蛋白信号,含量不受处理条件影响的特点。
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