在之前的文章里,分享了“菌落计数”国家标准的制定和演变。要严谨地实现计数操作,需要按照规范的步骤来进行。今天,我们就来了解菌落计数的具体步骤吧。
固体和半固体样品
称取25 g置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min均质1min~2 min,或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2 min,制成1:10的样品匀液。
液体样品
以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。
上步完成后,用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL,沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。
移液过程使用的器具,都应避免微生物污染。使用耐高压移液枪,核查洗耳球无菌程度,避免移液枪触及均质袋或试管内壁……
样品匀液完成后,可按相同操作,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1 mL无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
之后,及时将15 mL~20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
待琼脂凝固后,将平板翻转,36 ℃±1 ℃培养48 h±2h。水产品30 ℃±1 ℃培养72h±3 h。
如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基 (约4mL),凝固后翻转平板,按相同条件进行培养。
培养完成后,就要进行菌落计数了,计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units, CFU)表示。
选取菌落数在30 CFU~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数,大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
结果与报告
为了生成结果和报告,需要根据计数结果和公式计算出菌落总数。需要注意的是,对于菌落数量不同的培养皿,计数原则有所不同。
若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
自此,菌落计数的步骤就这样完成了。正确的技术结果要求严谨地操作过程,相信大家已经充分了解了。除了计数操作,质量控制也是微生物环境安全管理的重要一环。菌落计数知多少,想要了解有关质量控制的相关内容,就请关注我们的后续推送吧。
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