Science主刊 | FIDA携手ReS19-T小分子为阿尔茨海默病治疗带来新希望与新靶点

研究背景：利用FIDA确定ReS19-T与阿尔兹海默症治疗新靶点作用机制
异常钙信号是阿尔茨海默病（AD）的核心病理组成部分。本研究筛选出了ReS19-T的化合物，它能够在基于细胞的tau病理模型中恢复钙稳态。异常的tau积累导致通过重塑细胞皮质的septin丝体不受控制地激活储存操作钙通道（SOCCs）。ReS19-T与septin结合，可以在疾病状态下恢复丝体的组装，并抑制SOCCs的钙离子进入。在由淀粉样β和tau驱动的小鼠疾病模型中，ReS19-T药物恢复突触可塑性，使脑网络活动正常化，并减轻淀粉样蛋白β和tau病理的发展。研究结果确定了septin细胞骨架是开发疾病修饰性AD治疗的潜在治疗靶点。
 

FIDA技术的关键作用
这项研究中，层流诱导分散分析（FIDA）技术发挥了至关重要的作用。文章中，由于septin蛋白容易聚集，导致常规互作技术无法得到有效数据，FIDA技术采用无需标记和无需固定的方式，完全的In-solution Labelfree，解决了蛋白因为固定或标记导致的分子结构与功能的异常的问题，而且FIDA通过同步的粒径（Rh）与构象（BRIC）分析对亲和力进行了两维表征。利用FIDA，研究人员精确测量了ReS19-T化合物与无标记的septin 6丝状蛋白的高亲和力结合，揭示了通过ReS19-T与septin 6的结合来恢复septin丝状结构的完整性，进而防止了病理状态下SOCCs的异常激活，这对于理解ReS19-T的药理作用机制至关重要。
 

研究思路
通过筛选内部化合物库识别出具有保护作用的化合物ReS19-T，并进行三杂交确定SEPT6为待选高亲和力靶点

通过开发细胞基础筛选测定，模拟tau和钙引起的神经毒性，筛选内部化合物库，发现了具有保护作用的化合物ReS19-T及其衍生物。研究表明，REM127是最有效的化合物，能够降低细胞内钙浓度并对抗tau和淀粉样蛋白引起的神经毒性。此外，SEPT6被确定为ReS19-T的主要靶点，与ReS19-T有较强的结合能力，可能与tau及细胞骨架的关系密切。
 

图1通过多轮筛选确定REM127（ReS19-T），是该系列中最有效的化合物，降低毒性和[Ca2+]细胞，中位有效浓度（ec50）分别为15和19 nM（图1A），但对tau表达或atra依赖的基因转录没有影响（C和D）
 

图2，胞内相互作用，不同septin亚型的MFC （REM929 - linked to甲氨蝶呤）（N = 3，误差条表示SD）。插图显示了在三杂交实验中探测到的septin同种异构体的系统发育分析

利用FIDA labelfree确定REM127（ReS19-T）与纯化的septin同种型的结合亲和力
文章中检测了小分子REM127（ReS19-T）与纯化的septin同种型的结合，使用层流诱导分散分析（FIDA），无标记和无固定化的通过测量水动力学半径大小（Rh）和构象（BRIC）的变化来量化生物分子相互作用。在这些实验中，septin同种型在高盐条件下维持，以防止聚集。REM127诱导了SEPT6的水动力半径（Rh）的浓度依赖性增加，当将其拟合到结合曲线时，计算出表观解离常数（Kd_app）为1.5 nM。基于构象的结合相关荧光强度变化（BRIC）测量Kd_app也得到了相近的值1.6 nM（图3A，D）。

对于SEPT7和SEPT2未检测到化合物诱导的水动力半径变化。这些体外结合研究表明REM127直接与SEPT6高亲和力结合，并可能影响靶点构象。研究还提供了REM127与SEPT7和SEPT2之间较弱结合的证据。
 

图3 REM127与SEPT6的亲和力曲线，（A）水动力学半径（Rh）拟合的亲和力曲线（D）BRIC拟合的亲和力曲线（B）(C)分别为REM127与SEPT7和SEPT2之间亲和力曲线

在验证REM127与SEPT6具有高亲和力后进一步探讨其在调节SOCE和钙稳态中的作用

SEPT6的沉默会降低REM127对毒性和细胞内钙浓度的抑制作用，表明SEPT6在药效中的重要性。tauP301L显著增加细胞内钙浓度和SOCE的振幅，而REM127能够恢复这些指标至正常水平。SOCE在tauP301L状态下被激活，导致细胞内钙过载，并可通过靶向SEPT6或抑制SOC通道来缓解毒性。所以REM127通过抑制tau诱导的SOCE及其对SEPT6的高亲和力结合，恢复钙稳态，从而有望作为治疗阿尔茨海默病的候选药物。

图4，tauP301L显著增加细胞内钙浓度和SOCE的振幅REM127能够恢复这些指标

ReS19-T调节septin可恢复患者源性iPSC神经元和AD小鼠模型的网络功能并减轻AD病理发展

在表达人tauP301S（一种引起FTD的突变）或携带AD家族突变V717I （APP- ln）的APP London突变的转基因小鼠中，研究了REM127对突触可塑性的影响。两种神经退行性变模型均显示海马CA1区长期增强（LTP）的严重缺陷（图C和D），这是一种与学习和记忆相关的突触效能的活性和钙依赖性增加形式。口服REM127可恢复tauP301S和APP-Ln小鼠的LTP（图C和D）。用该化合物治疗7天足以恢复APP-Ln小鼠的LTP（图D）
 

图5（C）WT和tauP301S小鼠（3.5月龄，每组N = 8）给予载药或REM127 （20 mg/kg/天）2个月CA1 LTP。箭头表示LTP诱导刺激。(D) WT/Veh （N = 5）、APP-Ln/Veh （N = 8）和APP-Ln/REM127 （N = 6）小鼠（7月龄）灌胃或REM127 （20 mg/kg/天）7 D后CA1 LTP的变化

除了介导神经元变性外，异常钙信号被认为促进了AD病理的发展。因此，我们假设通过ReS19-T抑制病变神经元中的钙内流可以减轻AD小鼠模型的病理。双源性APP-Ln的治疗：PS1（A246E）用REM127治疗3个月后，新皮质（图7）和托下（连接内鼻皮层和海马体的结构）中的Ab斑块堆积减少了55%至60%。这两个大脑区域都很突出。
 

图6（A至D） APP-Ln:PS1（A246E）小鼠3个月后给药（N = 16）或口服REM127 (N = 12)，剂量为20mg /kg/天。（A至C）抗淀粉样蛋白原纤维染色的Ab斑块皮质[(A)和(B)]和托骨下[(A)和(C)]的LOC抗体。(D)皮层CD11b免疫反应性

FIDA的技术优势

1. 无需标记和固定：对于大多数小分子与蛋白互作实验可以通过FIDA的280nm光学模块无标记的Labelfree方式检测，FIDA技术无需固定、无需加热，无需标记。

2. 数据QC与正交验证：FIDA技术提供的是第一性原理的水动力学绝对值检测，因此数据准确可靠。可同步构象改变(BRIC)进行正交亲和力验证。并可在实验的全流程进行样品的8个关键质量参数的质控。

3. 灵敏度高：FIDA技术的灵敏度极高，并能够检测到小于1%的Rh变化，这对于评估小分子药物的结合亲和力等参数非常有用。

4. 样品消耗少：本实验中 SEPT7 浓度为6 uM，单次检测只需要40nL，只需要极少量的蛋白样品，分析物（REM127）从0-250nM完成滴定。