在测定ELISA试剂盒时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。ELISA试剂盒再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA试剂盒也可用于测定抗体。
显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD 产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。ELISA试剂盒但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。T MB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，ELISA试剂盒各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
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