ELISA试剂盒操作方法
(1)将抗原结合在酶标板上。取标准IgG(10mg/mL)用碳酸盐缓冲溶液稀释,得到浓度为0.1μg/mL的包被液,每孔加人100μL抗原包被液,并以不加标准抗原的两孔为对照,为反应的0%值,将反应板于4℃放置一夜(8个样品,分3个平行,4个100%值孔;共28+2孔)。
(2)标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG(10mg/mL)用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG(4μg/mL至0.325μg/mL)各200μL,加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中,其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应放置一夜。
(3)封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去,进行洗涤,各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min,倒掉,如此重复4次后,在吸水纸上拍干,ELISA试剂盒加封闭液进行封闭,在37℃放置45min(注意:空白孔也要加封闭液)。封闭后,如前述洗涤。
ELISA试剂盒可用于测定抗体,也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂: ①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂); ②酶标记的抗原或抗体(标记物); ③酶作用的底物(显色剂)。
ELISA试剂盒过程包括:抗原吸附在固相载体上,这个过程称为包被,加待测抗体, 再加相应酶标记抗体,生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。
根据检测目的和操作步骤不同,
3.1间接法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后,加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。
3.2双抗体夹心法 此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体,加人待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤,加人酶标板中。
3.3竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,将特异性抗体吸附于固相载体。ELISA试剂盒加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原,ELISA试剂盒使二者竟争与固相抗体结合;经过洗涤分离,最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。
一、酶联免疫吸附法测定抗体含量(竞争法)
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